Identification d’espèces animales dans des produits alimentaires par PCR en temps réel / Maxime GUADAGNIN

Public ISBD Titre : Identification d’espèces animales dans des produits alimentaires par PCR en temps réel Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Maxime GUADAGNIN, Auteur ; Frédéric Debode, Directeur de publication, rédacteur en chef Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  CRA-W Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : De par le monde, de nombreuses personnes consomment chaque jour de la viande. Celle-ci est une source de protéines essentielles pour l’homme et fait souvent l’objet de polémiques. En Belgique, une importante part des animaux consommés sont issus de l’élevage intensif (Cochon : 97% ; Poulet : 90% ; Veau : 70%). Différents comportements existent selon les consommateurs. Pour certains, la viande ne doit pas être consommée en de trop grande quantité pour des raisons de santé. D’autres estiment que l’on peut très bien s’en passer et deviennent végétariens voire végétaliens. Rappelons que la religion joue également un rôle, les personnes de confession juive ou musulmane ne peuvent pas consommer de viande porcine. Ces réticences à manger de la viande ainsi que le contexte économique défavorable impactent le secteur viandeux et mettent certains producteurs en mauvaise posture. Ces dernières années, des crises ont également frappées le secteur de la viande. Citons les exemples de la crise de la vache folle qui a marqué les esprits et la découverte de viande de cheval dans des lasagnes 100% pur boeuf. Ces crises ont été causées par l’adultération de produits alimentaires destinés, dans le premier cas, pour le bétail et dans le deuxième, pour l’homme. En effet, des producteurs en difficultés choisissent de remplacer leur matière première par une autre moins coûteuse. Suite à ces évènements, des mesures ont été prises et des lois ont été votées, tant du côté des instances Belges que du côté Européen. Afin de vérifier si le cadre légal est respecté, il faut pouvoir effectuer des analyses capables de déceler la présence d’espèces animales non désirées dans des produits alimentaires. Différentes méthodes d’analyses existent, celles-ci détectent notamment la présence de protéines ou d’ADN spécifiques à une espèce donnée. Suite aux recherches effectuées dans le cadre de ce travail de fin d’étude, l’ADN a été choisi comme source d’information. Différentes cibles se basant sur le gène cytochrome b ont été testées et évaluées. Tout d’abord par bioinformatique et ensuite par PCR en temps réel. Ainsi, un total de 17 cibles ont été sélectionnées dans la littérature ou conçues, dont 4 ont pu être testées. Ces dernières sont capables de détecter la présence de boeuf, de porc, de mouton et de poulet. La spécificité de ces cibles a été évaluée sur 34 espèces. Enfin, la sensibilité de la cible PCR en temps réel du boeuf a également pu être déterminée. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7 Introduction ................................................................................................................................ 9 1 État de l’art ....................................................................................................................... 12 La viande ................................................................................................................... 12 Pourquoi authentifier nos aliments ?....................................................................... 12 Législation ................................................................................................................. 13 Études menées ......................................................................................................... 13 L’ADN et l’ARN .......................................................................................................... 15 La PCR en temps réel ................................................................................................ 16 2 Objectifs de l’étude .......................................................................................................... 17 3 Matériel et méthodes ...................................................................................................... 18 Recherche de séquences d’intérêts ......................................................................... 18 Nettoyage et décontamination ................................................................................ 20 Préparation des échantillons .................................................................................... 20 Technique d’extraction ............................................................................................ 23 Quantité et qualité de l’ADN .................................................................................... 24 Analyse PCR .............................................................................................................. 25 Le clonage ................................................................................................................. 29 L’électrophorèse ....................................................................................................... 31 4 Synthèse ........................................................................................................................... 32 5 Résultats et discussion ..................................................................................................... 33 Recherche des amorces et sondes ........................................................................... 33 Homologie entre espèces animales ......................................................................... 37 Évaluation de la spécificité ....................................................................................... 38 Évaluation de la sensibilité des cibles PCR en temps réel ........................................ 41 Conclusion générale et perspectives ....................................................................................... 45 6 Glossaire ........................................................................................................................... 47 7 Illustrations ....................................................................................................................... 49 8 Tableaux ........................................................................................................................... 49 9 Bibliographie ....................................................................................................................... l Revues scientifiques .................................................................................................... l Pages web .................................................................................................................. lv Syllabi et TFE ............................................................................................................. lvii Autres ....................................................................................................................... lvii 10 Annexes ........................................................................................................................... lviii Protocole CTAB .......................................................................................................... lix Protocole clonage .................................................................................................... lxiv Publications ........................................................................................................... lxxv Alignement myosine ................................................................................................. cv Alignement actine ................................................................................................... cvi Alignement tubuline ............................................................................................... cvii Alignement facteur d’élongation 1 α .................................................................... cviii Séquences ................................................................................................................. cix Amorces et sondes ................................................................................................... cxi Homologie .......................................................................................................... cxiii Alignements entre espèces homologues ............................................................ cxv Alignements Clustal et Jalview ............................................................................ cxx Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65874 Identification d’espèces animales dans des produits alimentaires par PCR en temps réel [TFE / Mémoire] / Maxime GUADAGNIN, Auteur ; Frédéric Debode, Directeur de publication, rédacteur en chef . - 2017. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  CRA-W Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : De par le monde, de nombreuses personnes consomment chaque jour de la viande. Celle-ci est une source de protéines essentielles pour l’homme et fait souvent l’objet de polémiques. En Belgique, une importante part des animaux consommés sont issus de l’élevage intensif (Cochon : 97% ; Poulet : 90% ; Veau : 70%). Différents comportements existent selon les consommateurs. Pour certains, la viande ne doit pas être consommée en de trop grande quantité pour des raisons de santé. D’autres estiment que l’on peut très bien s’en passer et deviennent végétariens voire végétaliens. Rappelons que la religion joue également un rôle, les personnes de confession juive ou musulmane ne peuvent pas consommer de viande porcine. Ces réticences à manger de la viande ainsi que le contexte économique défavorable impactent le secteur viandeux et mettent certains producteurs en mauvaise posture. Ces dernières années, des crises ont également frappées le secteur de la viande. Citons les exemples de la crise de la vache folle qui a marqué les esprits et la découverte de viande de cheval dans des lasagnes 100% pur boeuf. Ces crises ont été causées par l’adultération de produits alimentaires destinés, dans le premier cas, pour le bétail et dans le deuxième, pour l’homme. En effet, des producteurs en difficultés choisissent de remplacer leur matière première par une autre moins coûteuse. Suite à ces évènements, des mesures ont été prises et des lois ont été votées, tant du côté des instances Belges que du côté Européen. Afin de vérifier si le cadre légal est respecté, il faut pouvoir effectuer des analyses capables de déceler la présence d’espèces animales non désirées dans des produits alimentaires. Différentes méthodes d’analyses existent, celles-ci détectent notamment la présence de protéines ou d’ADN spécifiques à une espèce donnée. Suite aux recherches effectuées dans le cadre de ce travail de fin d’étude, l’ADN a été choisi comme source d’information. Différentes cibles se basant sur le gène cytochrome b ont été testées et évaluées. Tout d’abord par bioinformatique et ensuite par PCR en temps réel. Ainsi, un total de 17 cibles ont été sélectionnées dans la littérature ou conçues, dont 4 ont pu être testées. Ces dernières sont capables de détecter la présence de boeuf, de porc, de mouton et de poulet. La spécificité de ces cibles a été évaluée sur 34 espèces. Enfin, la sensibilité de la cible PCR en temps réel du boeuf a également pu être déterminée. Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7 Introduction ................................................................................................................................ 9 1 État de l’art ....................................................................................................................... 12 La viande ................................................................................................................... 12 Pourquoi authentifier nos aliments ?....................................................................... 12 Législation ................................................................................................................. 13 Études menées ......................................................................................................... 13 L’ADN et l’ARN .......................................................................................................... 15 La PCR en temps réel ................................................................................................ 16 2 Objectifs de l’étude .......................................................................................................... 17 3 Matériel et méthodes ...................................................................................................... 18 Recherche de séquences d’intérêts ......................................................................... 18 Nettoyage et décontamination ................................................................................ 20 Préparation des échantillons .................................................................................... 20 Technique d’extraction ............................................................................................ 23 Quantité et qualité de l’ADN .................................................................................... 24 Analyse PCR .............................................................................................................. 25 Le clonage ................................................................................................................. 29 L’électrophorèse ....................................................................................................... 31 4 Synthèse ........................................................................................................................... 32 5 Résultats et discussion ..................................................................................................... 33 Recherche des amorces et sondes ........................................................................... 33 Homologie entre espèces animales ......................................................................... 37 Évaluation de la spécificité ....................................................................................... 38 Évaluation de la sensibilité des cibles PCR en temps réel ........................................ 41 Conclusion générale et perspectives ....................................................................................... 45 6 Glossaire ........................................................................................................................... 47 7 Illustrations ....................................................................................................................... 49 8 Tableaux ........................................................................................................................... 49 9 Bibliographie ....................................................................................................................... l Revues scientifiques .................................................................................................... l Pages web .................................................................................................................. lv Syllabi et TFE ............................................................................................................. lvii Autres ....................................................................................................................... lvii 10 Annexes ........................................................................................................................... lviii Protocole CTAB .......................................................................................................... lix Protocole clonage .................................................................................................... lxiv Publications ........................................................................................................... lxxv Alignement myosine ................................................................................................. cv Alignement actine ................................................................................................... cvi Alignement tubuline ............................................................................................... cvii Alignement facteur d’élongation 1 α .................................................................... cviii Séquences ................................................................................................................. cix Amorces et sondes ................................................................................................... cxi Homologie .......................................................................................................... cxiii Alignements entre espèces homologues ............................................................ cxv Alignements Clustal et Jalview ............................................................................ cxx Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65874

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