Communication bactérienne inter-espèces : stimulation du potentiel antibiotique de Bacillus amyloliquefaciens par Pseudomonas sp. / Nicolas Berthaux

Public ISBD Titre : Communication bactérienne inter-espèces : stimulation du potentiel antibiotique de Bacillus amyloliquefaciens par Pseudomonas sp. Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Nicolas Berthaux, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  Gembloux agro bio-tech Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : L’exploitation non durable des surfaces agricoles a des conséquences catastrophiques sur l’environnement et les êtres vivants malgré le fait qu’elle puisse cultiver des plantes dans des conditions favorables. L’utilisation abusive de pesticides et de produits phytosanitaires entraîne des lessivages et des ruissellements polluants considérablement l’eau et le sol. Heureusement, des scientifiques tentent d’apporter des solutions à ce type de problématique, par l’introduction de la lutte biologique dans la gestion des systèmes agricoles. Ceci permettant d’endiguer les maladies causées aux végétaux. Des organismes possédants de telles caractéristiques sont qualifiés d’agents de biocontrôle. Ce travail de fin d’études s’est intéressé sur le règne des Monères et plus particulièrement à Bacillus amyloliquefaciens. Il s’agit d’une espèce bactérienne aux propriétés étonnantes et particulièrement intéressantes, grâce à la production de métabolites secondaires permettant l’inhibition de certains agents pathogènes. Concernant la recherche proprement dite, les travaux réalisés se sont axés sur plusieurs souches couplées avec différents surnageants de Pseudomonas. En émettant l’hypothèse que certains d’entre eux pourraient stimuler positivement la production de métabolites secondaires chez Bacillus amyloliquefaciens. Ces expériences ont été réalisées en milieu liquide et solide sur base de l’élaboration, la mise en place et la standardisation d’un protocole. Le but étant de faire un screening avec la souche S499 de cette espèce bactérienne. Pour arriver à cela, quatre bactéries pathogènes ont été choisies et testées pour mettre en évidence ces interactions : Pseudomonas syringae DC3000, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganensis ainsi que Xanthomonas campestris. La sélection de plusieurs surnageant de Pseudomonas sp a permis ensuite de tester diverses expériences sur plusieurs souches de Bacillus amyloliquefaciens : S499, QST713, 98S, FZB42 et GA1. Cette sélection ayant pour but de déterminer le surnageant qui possède le pouvoir de stimulation le plus intéressant et par après de trouver la ou les molécules inhibitrices surexprimées. Note de contenu : Table des matières Remerciements Présentation du lieu de stage Introduction Partie théorique 1. La rhizosphère ................................................................................................................................. 4 2. Les agents de biocontrôle ............................................................................................................... 5 3. PGPR ................................................................................................................................................ 6 4. Bacillus amyloliquefaciens ............................................................................................................... 7 4.1 Bacillus amyloliquefaciens S499 .............................................................................................. 8 5. Phytopathogène .............................................................................................................................. 9 5.1 Erwinia carotovora ................................................................................................................ 10 5.2 Clavibacter michiganensis ..................................................................................................... 11 5.3 Xanthomonas Campestris...................................................................................................... 11 5.4 Pseudomonas syringae DC3000 ............................................................................................ 12 6. Les métabolites secondaires ......................................................................................................... 13 6.1 Bactériocines ......................................................................................................................... 13 6.2 Les polykétides ...................................................................................................................... 14 6.3 Lipopeptides .......................................................................................................................... 15 6.3.1 La surfactine .................................................................................................................. 17 6.3.2 L’iturine .......................................................................................................................... 18 6.3.3 La fengycine ................................................................................................................... 18 Objectif et stratégie 1. Objectifs et stratégie ..................................................................................................................... 20 Matériel et méthode 1. Matériel ......................................................................................................................................... 22 Spectramax M2...................................................................................................................... 22 1.2 Spectrophotomètre VWR V-1200 .......................................................................................... 23 1.3 UPLC Acquity H waters .......................................................................................................... 24 2. Méthode ........................................................................................................................................ 27 Protocole de screening sur Bacillus amyloliquefaciens S499 ................................................ 27 2.1.1 J-3 .................................................................................................................................. 28 2.1.2 J0 .................................................................................................................................... 29 2.1.3 J+1 .................................................................................................................................. 33 2.1.4 J+2 .................................................................................................................................. 33 Résultats 1. Screening d’une banque de souches de Pseudomonas sp pour leur potentiel de stimulation de l’activité antibactérienne de Bacillus amyloliquefaciens ...................................................................... 37 1.1 Activité antibiotique produite par les colonies de S499 sur milieu gélosé ........................... 37 1.2 Activité antibiotique des molécules produites par S499 ....................................................... 38 1.2.1 Test antibactérien sur milieu gélosé RE ½ ..................................................................... 39 1.2.2 Inhibition de croissance en milieu liquide ..................................................................... 39 1.2.2.1 Densité optique finale en microplaque ..................................................................... 39 1.2.2.2 Cinétique de croissance au Spectramax avec sept surnageants de co-cultures ....... 42 2. Effet stimulant des extraits de Pseudomonas sp les plus actifs sur l’activité antibiotique de cinq souches de Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................. 45 2.1 Stimulation des trois extraits de Pseudomonas sp sur les cinq souches de Bacillus amyloliquefaciens .............................................................................................................................. 46 3. Stimulation de l’activité antibactérienne de la souche QST713 co-cultivée en présence de Pseudomonas sp A.214 .......................................................................................................................... 48 4. Identification des composés antibiotiques stimulés chez Bacillus amyloliquefaciens QST713 .... 53 4.1 Analyse des extraits bruts par UPLC-MS ............................................................................... 53 4.2 Fractionnement sur C18 et corrélation entre l’activité antibactérienne et leur contenu en oxy-difficidine ou autre ..................................................................................................................... 55 4.2.1 Test sur milieu gélosé RE ½ en puits des fractions éluées sur C18 ............................... 55 4.2.2 Test des fractions en microplaque vis-à-vis des 4 bactéries pathogènes ..................... 57 4.3 Cinétique d’accumulation des métabolites et RTqPCR sur les gènes oxy-difficidine et ercine S 59 Conclusion 1. Conclusion ..................................................................................................................................... 63 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65869 Communication bactérienne inter-espèces : stimulation du potentiel antibiotique de Bacillus amyloliquefaciens par Pseudomonas sp. [TFE / Mémoire] / Nicolas Berthaux, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef . - 2017. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie  AIBT  Gembloux agro bio-tech Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : L’exploitation non durable des surfaces agricoles a des conséquences catastrophiques sur l’environnement et les êtres vivants malgré le fait qu’elle puisse cultiver des plantes dans des conditions favorables. L’utilisation abusive de pesticides et de produits phytosanitaires entraîne des lessivages et des ruissellements polluants considérablement l’eau et le sol. Heureusement, des scientifiques tentent d’apporter des solutions à ce type de problématique, par l’introduction de la lutte biologique dans la gestion des systèmes agricoles. Ceci permettant d’endiguer les maladies causées aux végétaux. Des organismes possédants de telles caractéristiques sont qualifiés d’agents de biocontrôle. Ce travail de fin d’études s’est intéressé sur le règne des Monères et plus particulièrement à Bacillus amyloliquefaciens. Il s’agit d’une espèce bactérienne aux propriétés étonnantes et particulièrement intéressantes, grâce à la production de métabolites secondaires permettant l’inhibition de certains agents pathogènes. Concernant la recherche proprement dite, les travaux réalisés se sont axés sur plusieurs souches couplées avec différents surnageants de Pseudomonas. En émettant l’hypothèse que certains d’entre eux pourraient stimuler positivement la production de métabolites secondaires chez Bacillus amyloliquefaciens. Ces expériences ont été réalisées en milieu liquide et solide sur base de l’élaboration, la mise en place et la standardisation d’un protocole. Le but étant de faire un screening avec la souche S499 de cette espèce bactérienne. Pour arriver à cela, quatre bactéries pathogènes ont été choisies et testées pour mettre en évidence ces interactions : Pseudomonas syringae DC3000, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganensis ainsi que Xanthomonas campestris. La sélection de plusieurs surnageant de Pseudomonas sp a permis ensuite de tester diverses expériences sur plusieurs souches de Bacillus amyloliquefaciens : S499, QST713, 98S, FZB42 et GA1. Cette sélection ayant pour but de déterminer le surnageant qui possède le pouvoir de stimulation le plus intéressant et par après de trouver la ou les molécules inhibitrices surexprimées. Note de contenu : Table des matières Remerciements Présentation du lieu de stage Introduction Partie théorique 1. La rhizosphère ................................................................................................................................. 4 2. Les agents de biocontrôle ............................................................................................................... 5 3. PGPR ................................................................................................................................................ 6 4. Bacillus amyloliquefaciens ............................................................................................................... 7 4.1 Bacillus amyloliquefaciens S499 .............................................................................................. 8 5. Phytopathogène .............................................................................................................................. 9 5.1 Erwinia carotovora ................................................................................................................ 10 5.2 Clavibacter michiganensis ..................................................................................................... 11 5.3 Xanthomonas Campestris...................................................................................................... 11 5.4 Pseudomonas syringae DC3000 ............................................................................................ 12 6. Les métabolites secondaires ......................................................................................................... 13 6.1 Bactériocines ......................................................................................................................... 13 6.2 Les polykétides ...................................................................................................................... 14 6.3 Lipopeptides .......................................................................................................................... 15 6.3.1 La surfactine .................................................................................................................. 17 6.3.2 L’iturine .......................................................................................................................... 18 6.3.3 La fengycine ................................................................................................................... 18 Objectif et stratégie 1. Objectifs et stratégie ..................................................................................................................... 20 Matériel et méthode 1. Matériel ......................................................................................................................................... 22 Spectramax M2...................................................................................................................... 22 1.2 Spectrophotomètre VWR V-1200 .......................................................................................... 23 1.3 UPLC Acquity H waters .......................................................................................................... 24 2. Méthode ........................................................................................................................................ 27 Protocole de screening sur Bacillus amyloliquefaciens S499 ................................................ 27 2.1.1 J-3 .................................................................................................................................. 28 2.1.2 J0 .................................................................................................................................... 29 2.1.3 J+1 .................................................................................................................................. 33 2.1.4 J+2 .................................................................................................................................. 33 Résultats 1. Screening d’une banque de souches de Pseudomonas sp pour leur potentiel de stimulation de l’activité antibactérienne de Bacillus amyloliquefaciens ...................................................................... 37 1.1 Activité antibiotique produite par les colonies de S499 sur milieu gélosé ........................... 37 1.2 Activité antibiotique des molécules produites par S499 ....................................................... 38 1.2.1 Test antibactérien sur milieu gélosé RE ½ ..................................................................... 39 1.2.2 Inhibition de croissance en milieu liquide ..................................................................... 39 1.2.2.1 Densité optique finale en microplaque ..................................................................... 39 1.2.2.2 Cinétique de croissance au Spectramax avec sept surnageants de co-cultures ....... 42 2. Effet stimulant des extraits de Pseudomonas sp les plus actifs sur l’activité antibiotique de cinq souches de Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................. 45 2.1 Stimulation des trois extraits de Pseudomonas sp sur les cinq souches de Bacillus amyloliquefaciens .............................................................................................................................. 46 3. Stimulation de l’activité antibactérienne de la souche QST713 co-cultivée en présence de Pseudomonas sp A.214 .......................................................................................................................... 48 4. Identification des composés antibiotiques stimulés chez Bacillus amyloliquefaciens QST713 .... 53 4.1 Analyse des extraits bruts par UPLC-MS ............................................................................... 53 4.2 Fractionnement sur C18 et corrélation entre l’activité antibactérienne et leur contenu en oxy-difficidine ou autre ..................................................................................................................... 55 4.2.1 Test sur milieu gélosé RE ½ en puits des fractions éluées sur C18 ............................... 55 4.2.2 Test des fractions en microplaque vis-à-vis des 4 bactéries pathogènes ..................... 57 4.3 Cinétique d’accumulation des métabolites et RTqPCR sur les gènes oxy-difficidine et ercine S 59 Conclusion 1. Conclusion ..................................................................................................................................... 63 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65869

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