Centre de Documentation Campus Montignies
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Mardi : 8h-18h30
Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
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Auteur Mostafa BENTAHIR |
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Mise au point d'une méthode diagnostique pour la détection et le typage des souches vaccinales et virulentes africaines du virus de la fièvre jaune (YFV) par RT-qPCR et pyroséquençage / Anthony Tulli
Titre : Mise au point d'une méthode diagnostique pour la détection et le typage des souches vaccinales et virulentes africaines du virus de la fièvre jaune (YFV) par RT-qPCR et pyroséquençage Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Anthony Tulli, Auteur ; Mostafa BENTAHIR, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Centre de technologies moléculaires appliquées Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIERES
Institution d’accueil (présentation de l’entreprise) ...................................................................................... 6
Présentation ....................................................................................................................................................................6
Domaine d’activité et expertise .......................................................................................................................................7
Introduction .................................................................................................................................. 10
Contexte clinique ................................................................................................................................... 10
La maladie de la fièvre Jaune .........................................................................................................................................10
Structure du virus ..........................................................................................................................................................10
Cycle de vie ....................................................................................................................................................................12
Les hotes et vecteurs (définition, Distribution géographique et risque en europe) ......................................................13
Existence de traitement et de vaccins ...........................................................................................................................16
Les cas plus récents en Afrique ......................................................................................................................................17
Contexte général de l’étude. ................................................................................................................... 18
Méthodes de détection et d’identification existantes ...................................................................................................18
Immunologique .........................................................................................................................................................19
Moléculaires .............................................................................................................................................................20
Problématique de diagnostic (algorythm) .....................................................................................................................20
Objectif du travail .................................................................................................................................. 22
MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................. 24
Clonage ................................................................................................................................................. 24
A-tailing .........................................................................................................................................................................25
Principe .....................................................................................................................................................................25
Protocole ..................................................................................................................................................................25
Ligation ..........................................................................................................................................................................26
Principe .....................................................................................................................................................................26
Protocole ..................................................................................................................................................................27
Transformation ..............................................................................................................................................................27
Principe .....................................................................................................................................................................27
Protocole ..................................................................................................................................................................27
Screening PCR ................................................................................................................................................................28
PCR ............................................................................................................................................................................28
Principe ................................................................................................................................................................28
Protocole ..............................................................................................................................................................28
Electrophorèse sur gel d'agarose ..............................................................................................................................29
Principe ................................................................................................................................................................29
Protocole ..............................................................................................................................................................29
Culture milieu liquide et purification .............................................................................................................................30
Culture en milieu liquide ...........................................................................................................................................30
Principe ................................................................................................................................................................30
Protocole ..............................................................................................................................................................30
Purification des plasmides ........................................................................................................................................31
Principe ................................................................................................................................................................31
Protocole ..............................................................................................................................................................31
Cycle sequencing ...........................................................................................................................................................34
Principe .....................................................................................................................................................................34
Protocole ..................................................................................................................................................................34
Transcriptions in vitro ............................................................................................................................. 38
Préparation ADN matrice ...............................................................................................................................................38
PCR ............................................................................................................................................................................38
Principe ................................................................................................................................................................38
Protocole ..............................................................................................................................................................38
Purification des amplicons ........................................................................................................................................39
Principe ................................................................................................................................................................39
Protocole ..............................................................................................................................................................39
Transcription ..................................................................................................................................................................40
Production d’ARN in vitro .........................................................................................................................................40
Principe ................................................................................................................................................................40
Protocole ..............................................................................................................................................................40
Purification des produits ARN ...................................................................................................................................41
Principe ................................................................................................................................................................41
Protocole ..............................................................................................................................................................41
Elimination ADN matrice ......................................................................................................................... 44
Traitements à la DNase ..................................................................................................................................................44
Principe .....................................................................................................................................................................44
Protocole ..................................................................................................................................................................44
Biotinylation de l'ADN et élimination à l'aide de billes de stréptavidine ........................................................................45
Principe .....................................................................................................................................................................45
Protocole ..................................................................................................................................................................45
Quantification des acides nucléiques........................................................................................................ 48
Nanodrop : mesure de l’absorbance par spectrophotométrie ......................................................................................48
Principe ................................................................................................................................................................48
Protocole ..............................................................................................................................................................48
Qubit : mesure de la concentration par fluorimétrie .....................................................................................................48
Principe ................................................................................................................................................................48
Protocole ..............................................................................................................................................................48
PCR, qPCR et RT-qPCR ............................................................................................................................ 50
Amplification d'ADN par PCR en temps réel sur taqman® .............................................................................................50
Principe ................................................................................................................................................................50
Protocole ..............................................................................................................................................................52
Pyrosequençage .................................................................................................................................... 54
Principe .....................................................................................................................................................................54
Protocole ..................................................................................................................................................................55
Résultats et discussions .................................................................................................................. 58
Conception et design tests ...................................................................................................................... 58
Clonage ..........................................................................................................................................................................59
Séquençage SANGER .....................................................................................................................................................61
Transcription in vitro .....................................................................................................................................................61
Elimination de l’ADN matrice .........................................................................................................................................63
Tests préliminaires ....................................................................................................................................................63
Comparaison de plusieurs DNases ............................................................................................................................64
Optimisation du temps de traitement ......................................................................................................................65
Approche de la biotinylation de l’ADN matrice .........................................................................................................66
Limite de détection ........................................................................................................................................................67
RTqPCR ......................................................................................................................................................................67
Pyroséquençage ........................................................................................................................................................68
Etude de la présence de mélange d’ARN .......................................................................................................................69
Conclusions et perspectives ............................................................................................................ 73
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65857 Mise au point d'une méthode diagnostique pour la détection et le typage des souches vaccinales et virulentes africaines du virus de la fièvre jaune (YFV) par RT-qPCR et pyroséquençage [TFE / Mémoire] / Anthony Tulli, Auteur ; Mostafa BENTAHIR, Directeur de la recherche . - 2017.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Centre de technologies moléculaires appliquées Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : TABLE DES MATIERES
Institution d’accueil (présentation de l’entreprise) ...................................................................................... 6
Présentation ....................................................................................................................................................................6
Domaine d’activité et expertise .......................................................................................................................................7
Introduction .................................................................................................................................. 10
Contexte clinique ................................................................................................................................... 10
La maladie de la fièvre Jaune .........................................................................................................................................10
Structure du virus ..........................................................................................................................................................10
Cycle de vie ....................................................................................................................................................................12
Les hotes et vecteurs (définition, Distribution géographique et risque en europe) ......................................................13
Existence de traitement et de vaccins ...........................................................................................................................16
Les cas plus récents en Afrique ......................................................................................................................................17
Contexte général de l’étude. ................................................................................................................... 18
Méthodes de détection et d’identification existantes ...................................................................................................18
Immunologique .........................................................................................................................................................19
Moléculaires .............................................................................................................................................................20
Problématique de diagnostic (algorythm) .....................................................................................................................20
Objectif du travail .................................................................................................................................. 22
MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................. 24
Clonage ................................................................................................................................................. 24
A-tailing .........................................................................................................................................................................25
Principe .....................................................................................................................................................................25
Protocole ..................................................................................................................................................................25
Ligation ..........................................................................................................................................................................26
Principe .....................................................................................................................................................................26
Protocole ..................................................................................................................................................................27
Transformation ..............................................................................................................................................................27
Principe .....................................................................................................................................................................27
Protocole ..................................................................................................................................................................27
Screening PCR ................................................................................................................................................................28
PCR ............................................................................................................................................................................28
Principe ................................................................................................................................................................28
Protocole ..............................................................................................................................................................28
Electrophorèse sur gel d'agarose ..............................................................................................................................29
Principe ................................................................................................................................................................29
Protocole ..............................................................................................................................................................29
Culture milieu liquide et purification .............................................................................................................................30
Culture en milieu liquide ...........................................................................................................................................30
Principe ................................................................................................................................................................30
Protocole ..............................................................................................................................................................30
Purification des plasmides ........................................................................................................................................31
Principe ................................................................................................................................................................31
Protocole ..............................................................................................................................................................31
Cycle sequencing ...........................................................................................................................................................34
Principe .....................................................................................................................................................................34
Protocole ..................................................................................................................................................................34
Transcriptions in vitro ............................................................................................................................. 38
Préparation ADN matrice ...............................................................................................................................................38
PCR ............................................................................................................................................................................38
Principe ................................................................................................................................................................38
Protocole ..............................................................................................................................................................38
Purification des amplicons ........................................................................................................................................39
Principe ................................................................................................................................................................39
Protocole ..............................................................................................................................................................39
Transcription ..................................................................................................................................................................40
Production d’ARN in vitro .........................................................................................................................................40
Principe ................................................................................................................................................................40
Protocole ..............................................................................................................................................................40
Purification des produits ARN ...................................................................................................................................41
Principe ................................................................................................................................................................41
Protocole ..............................................................................................................................................................41
Elimination ADN matrice ......................................................................................................................... 44
Traitements à la DNase ..................................................................................................................................................44
Principe .....................................................................................................................................................................44
Protocole ..................................................................................................................................................................44
Biotinylation de l'ADN et élimination à l'aide de billes de stréptavidine ........................................................................45
Principe .....................................................................................................................................................................45
Protocole ..................................................................................................................................................................45
Quantification des acides nucléiques........................................................................................................ 48
Nanodrop : mesure de l’absorbance par spectrophotométrie ......................................................................................48
Principe ................................................................................................................................................................48
Protocole ..............................................................................................................................................................48
Qubit : mesure de la concentration par fluorimétrie .....................................................................................................48
Principe ................................................................................................................................................................48
Protocole ..............................................................................................................................................................48
PCR, qPCR et RT-qPCR ............................................................................................................................ 50
Amplification d'ADN par PCR en temps réel sur taqman® .............................................................................................50
Principe ................................................................................................................................................................50
Protocole ..............................................................................................................................................................52
Pyrosequençage .................................................................................................................................... 54
Principe .....................................................................................................................................................................54
Protocole ..................................................................................................................................................................55
Résultats et discussions .................................................................................................................. 58
Conception et design tests ...................................................................................................................... 58
Clonage ..........................................................................................................................................................................59
Séquençage SANGER .....................................................................................................................................................61
Transcription in vitro .....................................................................................................................................................61
Elimination de l’ADN matrice .........................................................................................................................................63
Tests préliminaires ....................................................................................................................................................63
Comparaison de plusieurs DNases ............................................................................................................................64
Optimisation du temps de traitement ......................................................................................................................65
Approche de la biotinylation de l’ADN matrice .........................................................................................................66
Limite de détection ........................................................................................................................................................67
RTqPCR ......................................................................................................................................................................67
Pyroséquençage ........................................................................................................................................................68
Etude de la présence de mélange d’ARN .......................................................................................................................69
Conclusions et perspectives ............................................................................................................ 73
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