Centre de Documentation Campus Montignies
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Auteur BRUNO INFOSINO |
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Validation du rôle cytotoxique de l'acide pamitique sur des cellules myoblastiques et macrophagiques de souris. Investigation d'une nouvelle adipokine, la chémérine / BRUNO INFOSINO
Titre : Validation du rôle cytotoxique de l'acide pamitique sur des cellules myoblastiques et macrophagiques de souris. Investigation d'une nouvelle adipokine, la chémérine Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : BRUNO INFOSINO, Auteur Année de publication : 2016 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. . Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale obésité déséquilibre énergétique prédisposition génétique tissu adipeux adipokine culture cellulaire ARN analyse protéique acide palmitique chérémine Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 9
CONTEXTE GENERAL ....................................................................................................... 11
1 L’OBESITE ..................................................................................................................... 11
1.1 QUELQUES CHIFFRES .................................................................................................. 11
1.2 QU’EST-CE QUE L’OBESITE ? ....................................................................................... 12
1.3 LES CAUSES ................................................................................................................ 13
1.3.1 Déséquilibre énergétique ....................................................................................... 13
1.3.2 Prédisposition génétique ........................................................................................ 14
1.3.3 L’environnement .................................................................................................... 14
1.4 LES CONSEQUENCES ................................................................................................... 15
2 TISSUS TOUCHES PAR L’OBESITE ........................................................................ 15
2.1 LE TISSU ADIPEUX ....................................................................................................... 16
2.1.1 Le tissu adipeux sain .............................................................................................. 16
2.1.2 Altération du tissu adipeux .................................................................................... 17
2.2 LE MUSCLE ................................................................................................................. 19
3 LES ADIPOKINES ......................................................................................................... 20
OBJECTIFS ET STRATEGIE ............................................................................................. 25
MATERIEL ET METHODES .............................................................................................. 27
4 CULTURE CELLULAIRE ............................................................................................ 27
4.1 MATERIEL .................................................................................................................. 27
4.2 LIGNEES CELLULAIRES ............................................................................................... 27
4.3 DECONGELATION DES CELLULES ................................................................................ 28
4.4 CULTURE DES CELLULES ............................................................................................. 29
4.5 PASSAGE DES CELLULES ............................................................................................. 30
4.6 ENSEMENCEMENT DES CELLULES ............................................................................... 31
4.7 STERILITE ................................................................................................................... 31
4.8 TEST MYCOPLASME .................................................................................................... 32
4.9 PROTOCOLE EXPERIMENTAL : GROUPES ET DOSES DE TRAVAIL................................... 33
4.10 TEST MTT .................................................................................................................. 34
4.11 RECOLTE DES CELLULES ............................................................................................. 34
5 ANALYSE HISTOLOGIQUE ....................................................................................... 35
5.1 MATERIEL .................................................................................................................. 35
5.2 OIL RED O .................................................................................................................. 35
6 ANALYSE ARN .............................................................................................................. 36
6.1 MATERIEL .................................................................................................................. 36
6.2 EXTRACTION ARN ..................................................................................................... 37
6.2.1 Lyse cellulaire ........................................................................................................ 37
6.2.2 Filtration du lysat .................................................................................................. 37
6.2.3 Liaison de l’ARN sur la membrane ........................................................................ 38
6.2.4 Dessalage de la membrane de silice ...................................................................... 38
6.2.5 Digestion de l’ADN ................................................................................................ 38
6.2.6 Lavage et séchage de la membrane de silice ......................................................... 38
6.2.7 Elution de l’ARN total ............................................................................................ 39
6.3 DOSAGE DE L’ARN PAR SPECTROPHOTOMETRIE ........................................................ 39
6.4 RETRO-TRANSCRIPTION .............................................................................................. 39
6.5 ANALYSE PCR............................................................................................................ 40
6.5.1 PCR qualitative ...................................................................................................... 40
6.5.2 PCR quantitative .................................................................................................... 43
7 ANALYSE PROTEIQUE .............................................................................................. 45
7.1 MATERIEL .................................................................................................................. 45
7.2 EXTRACTION PROTEIQUE ............................................................................................ 46
7.3 DOSAGE PROTEIQUE PAR LE TEST BCA (BICINCHONIC ACID ; KIT PIERCE BCA PROTEIN ASSAY (THERMO FISHER SCIENTIFIC)) ................................................................... 46
7.4 PREPARATION DES GELS DE POLYACRYLAMIDE .......................................................... 47
7.5 ELECTROPHORESE ...................................................................................................... 49
7.6 BLOTTING ................................................................................................................... 49
7.7 BLOCAGE .................................................................................................................... 50
7.8 IMMUNODETECTION .................................................................................................... 50
7.9 REVELATION ............................................................................................................... 51
7.10 DENSITOMETRIE ......................................................................................................... 51
7.11 RECYCLAGE DE LA MEMBRANE ................................................................................... 51
RESULTATS .......................................................................................................................... 53
8 EFFET LIPOTOXIQUE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MYOBLASTIQUES DE SOURIS (C2C12) ........................................................................... 54
8.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 54
8.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 54
8.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE ET QUANTITATIVE ................................................................. 56
8.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 58
8.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 60
9 VALIDATION DE LA LIPOTOXICITE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MACROPHAGIQUES DE SOURIS (RAW 264.7) ...................................... 61
9.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 61
9.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 62
9.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE .............................................................................................. 64
9.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 65
9.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 66
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................... 67
CONCLUSION ....................................................................................................................... 71
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 73
ANNEXE ................................................................................................................................. 77Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65675 Validation du rôle cytotoxique de l'acide pamitique sur des cellules myoblastiques et macrophagiques de souris. Investigation d'une nouvelle adipokine, la chémérine [TFE / Mémoire] / BRUNO INFOSINO, Auteur . - 2016.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. .
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale obésité déséquilibre énergétique prédisposition génétique tissu adipeux adipokine culture cellulaire ARN analyse protéique acide palmitique chérémine Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières
INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 9
CONTEXTE GENERAL ....................................................................................................... 11
1 L’OBESITE ..................................................................................................................... 11
1.1 QUELQUES CHIFFRES .................................................................................................. 11
1.2 QU’EST-CE QUE L’OBESITE ? ....................................................................................... 12
1.3 LES CAUSES ................................................................................................................ 13
1.3.1 Déséquilibre énergétique ....................................................................................... 13
1.3.2 Prédisposition génétique ........................................................................................ 14
1.3.3 L’environnement .................................................................................................... 14
1.4 LES CONSEQUENCES ................................................................................................... 15
2 TISSUS TOUCHES PAR L’OBESITE ........................................................................ 15
2.1 LE TISSU ADIPEUX ....................................................................................................... 16
2.1.1 Le tissu adipeux sain .............................................................................................. 16
2.1.2 Altération du tissu adipeux .................................................................................... 17
2.2 LE MUSCLE ................................................................................................................. 19
3 LES ADIPOKINES ......................................................................................................... 20
OBJECTIFS ET STRATEGIE ............................................................................................. 25
MATERIEL ET METHODES .............................................................................................. 27
4 CULTURE CELLULAIRE ............................................................................................ 27
4.1 MATERIEL .................................................................................................................. 27
4.2 LIGNEES CELLULAIRES ............................................................................................... 27
4.3 DECONGELATION DES CELLULES ................................................................................ 28
4.4 CULTURE DES CELLULES ............................................................................................. 29
4.5 PASSAGE DES CELLULES ............................................................................................. 30
4.6 ENSEMENCEMENT DES CELLULES ............................................................................... 31
4.7 STERILITE ................................................................................................................... 31
4.8 TEST MYCOPLASME .................................................................................................... 32
4.9 PROTOCOLE EXPERIMENTAL : GROUPES ET DOSES DE TRAVAIL................................... 33
4.10 TEST MTT .................................................................................................................. 34
4.11 RECOLTE DES CELLULES ............................................................................................. 34
5 ANALYSE HISTOLOGIQUE ....................................................................................... 35
5.1 MATERIEL .................................................................................................................. 35
5.2 OIL RED O .................................................................................................................. 35
6 ANALYSE ARN .............................................................................................................. 36
6.1 MATERIEL .................................................................................................................. 36
6.2 EXTRACTION ARN ..................................................................................................... 37
6.2.1 Lyse cellulaire ........................................................................................................ 37
6.2.2 Filtration du lysat .................................................................................................. 37
6.2.3 Liaison de l’ARN sur la membrane ........................................................................ 38
6.2.4 Dessalage de la membrane de silice ...................................................................... 38
6.2.5 Digestion de l’ADN ................................................................................................ 38
6.2.6 Lavage et séchage de la membrane de silice ......................................................... 38
6.2.7 Elution de l’ARN total ............................................................................................ 39
6.3 DOSAGE DE L’ARN PAR SPECTROPHOTOMETRIE ........................................................ 39
6.4 RETRO-TRANSCRIPTION .............................................................................................. 39
6.5 ANALYSE PCR............................................................................................................ 40
6.5.1 PCR qualitative ...................................................................................................... 40
6.5.2 PCR quantitative .................................................................................................... 43
7 ANALYSE PROTEIQUE .............................................................................................. 45
7.1 MATERIEL .................................................................................................................. 45
7.2 EXTRACTION PROTEIQUE ............................................................................................ 46
7.3 DOSAGE PROTEIQUE PAR LE TEST BCA (BICINCHONIC ACID ; KIT PIERCE BCA PROTEIN ASSAY (THERMO FISHER SCIENTIFIC)) ................................................................... 46
7.4 PREPARATION DES GELS DE POLYACRYLAMIDE .......................................................... 47
7.5 ELECTROPHORESE ...................................................................................................... 49
7.6 BLOTTING ................................................................................................................... 49
7.7 BLOCAGE .................................................................................................................... 50
7.8 IMMUNODETECTION .................................................................................................... 50
7.9 REVELATION ............................................................................................................... 51
7.10 DENSITOMETRIE ......................................................................................................... 51
7.11 RECYCLAGE DE LA MEMBRANE ................................................................................... 51
RESULTATS .......................................................................................................................... 53
8 EFFET LIPOTOXIQUE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MYOBLASTIQUES DE SOURIS (C2C12) ........................................................................... 54
8.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 54
8.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 54
8.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE ET QUANTITATIVE ................................................................. 56
8.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 58
8.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 60
9 VALIDATION DE LA LIPOTOXICITE DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR LES CELLULES MACROPHAGIQUES DE SOURIS (RAW 264.7) ...................................... 61
9.1 EVALUATION DE LA MORTALITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR UN TEST MTT ...................................................................... 61
9.2 MISE EN EVIDENCE D’INCLUSIONS LIPIDIQUES INTRACELLULAIRES INDUITE PAR UN TRAITEMENT AVEC DIFFERENTES DOSES DE PA PAR LA COLORATION AU OIL RED O ............. 62
9.3 EFFET DE L’ACIDE PALMITIQUE SUR L’EXPRESSION DU GENE CODANT POUR L’AMPK-Α1 PAR RT-PCR QUALITATIVE .............................................................................................. 64
9.4 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DE LA FORME ACTIVEE DE L’AMPK (PHOSPHO-AMPK) AINSI QUE LA FORME TOTALE (AMPK) PAR WESTERN BLOT ................................... 65
9.5 EFFET DU PA SUR L’EXPRESSION DU RECEPTEUR A LA CHEMERINE (CMKLR1) PAR WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 66
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................... 67
CONCLUSION ....................................................................................................................... 71
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 73
ANNEXE ................................................................................................................................. 77Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65675 Exemplaires
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