ABONDANCE ET ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION HIF-1 DANS DIFFERENTES CONDITIONS D’HYPOXIE / Wiâme BEN EL MOSTAPHA

Public ISBD Titre : ABONDANCE ET ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION HIF-1 DANS DIFFERENTES CONDITIONS D’HYPOXIE Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Wiâme BEN EL MOSTAPHA, Auteur ; Guillaume Van Beersel, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  Université de Namur  Cellules souches cancéreuses  Sein : cancer Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ........................................................................................................7 Introduction générale ...................................................................................................................9 1. Introduction théorique ......................................................................................................... 11 1.1. Le sein .......................................................................................................................... 11 1.1.1. Structure du sein................................................................................................... 11 1.1.2. Cellules souches .................................................................................................... 13 1.1.3. Tumeur du sein .................................................................................................... 14 1.1.3.1. Généralités.................................................................................................... 14 1.1.3.2. Cellules souches cancéreuses ........................................................................ 16 1.2. Hypoxie ........................................................................................................................ 17 1.3. Facteur Inductible par l'Hypoxie (HIF) ........................................................................... 18 1.3.1. Généralités ........................................................................................................... 18 1.3.2. Rôle de HIF-1 en hypoxie....................................................................................... 19 1.3.3. HIF-1α ................................................................................................................... 20 1.3.4. Régulation du facteur HIF-1α ................................................................................ 21 1.3.4.1. Mécanisme de dégradation ........................................................................... 21 1.3.4.2. Mécanisme de stabilisation hypoxique .......................................................... 22 2. Objectifs............................................................................................................................... 23 3. Matériel et méthodes .......................................................................................................... 23 3.1. Culture cellulaire .......................................................................................................... 23 3.1.1. Lignée cellulaire utilisée ........................................................................................ 23 3.1.2. Culture cellulaire ................................................................................................... 24 3.2. Extraction de protéines et dosage................................................................................. 25 3.2.1. Extraction des protéines ....................................................................................... 25 3.2.2. Dosage protéique avec le réactif de Pierce ............................................................ 26 3.2.2.1. Principe ......................................................................................................... 26 3.2.2.2. Protocole ...................................................................................................... 27 3.3. Western blot ................................................................................................................ 28 3.3.1. Préparation des échantillons ................................................................................. 28 3.3.2. Préparation du gel polyacrylamide ........................................................................ 28 3.3.3. Chargement des protéines et électrophorèse ....................................................... 29 3.3.4. Transfert semi-humide .......................................................................................... 30 3.3.5. Incubation de la membrane avec les anticorps primaires et secondaires ............... 31 3.3.5.1. Fluorescence ................................................................................................. 31 3.3.5.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 32 3.3.6. Révélation et quantification .................................................................................. 33 3.3.6.1. Fluorescence ................................................................................................. 33 3.3.6.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 34 3.4. PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) ...................................................................... 34 3.4.1. Principe ................................................................................................................ 34 3.4.2. Extraction d’ARN ................................................................................................... 35 3.4.3. Transcription inverse ............................................................................................ 36 3.4.4. PCR en temps réel (RT-PCR) .................................................................................. 37 3.4.5. Analyse des résultats ............................................................................................ 38 4. Résultats et discussion ......................................................................................................... 39 4.1. Détection de la protéine HIF-1α .................................................................................... 39 4.1.1. Western blot « classique » et fluorescent .............................................................. 39 4.2. Analyse de l’expression de gènes cibles de HIF-1 .......................................................... 48 4.2.1. Expression du gène SOX2 ...................................................................................... 48 4.2.2. Expression du gène NDRG1B ................................................................................. 49 Conclusions et perspectives ........................................................................................................ 51 Liste des abréviations .................................................................................................................. 53 Bibliographie ............................................................................................................................... 55 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65561 ABONDANCE ET ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION HIF-1 DANS DIFFERENTES CONDITIONS D’HYPOXIE [TFE / Mémoire] / Wiâme BEN EL MOSTAPHA, Auteur ; Guillaume Van Beersel, Directeur de la recherche . - 2015. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  Université de Namur  Cellules souches cancéreuses  Sein : cancer Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Table des matières Présentation du lieu de stage ........................................................................................................7 Introduction générale ...................................................................................................................9 1. Introduction théorique ......................................................................................................... 11 1.1. Le sein .......................................................................................................................... 11 1.1.1. Structure du sein................................................................................................... 11 1.1.2. Cellules souches .................................................................................................... 13 1.1.3. Tumeur du sein .................................................................................................... 14 1.1.3.1. Généralités.................................................................................................... 14 1.1.3.2. Cellules souches cancéreuses ........................................................................ 16 1.2. Hypoxie ........................................................................................................................ 17 1.3. Facteur Inductible par l'Hypoxie (HIF) ........................................................................... 18 1.3.1. Généralités ........................................................................................................... 18 1.3.2. Rôle de HIF-1 en hypoxie....................................................................................... 19 1.3.3. HIF-1α ................................................................................................................... 20 1.3.4. Régulation du facteur HIF-1α ................................................................................ 21 1.3.4.1. Mécanisme de dégradation ........................................................................... 21 1.3.4.2. Mécanisme de stabilisation hypoxique .......................................................... 22 2. Objectifs............................................................................................................................... 23 3. Matériel et méthodes .......................................................................................................... 23 3.1. Culture cellulaire .......................................................................................................... 23 3.1.1. Lignée cellulaire utilisée ........................................................................................ 23 3.1.2. Culture cellulaire ................................................................................................... 24 3.2. Extraction de protéines et dosage................................................................................. 25 3.2.1. Extraction des protéines ....................................................................................... 25 3.2.2. Dosage protéique avec le réactif de Pierce ............................................................ 26 3.2.2.1. Principe ......................................................................................................... 26 3.2.2.2. Protocole ...................................................................................................... 27 3.3. Western blot ................................................................................................................ 28 3.3.1. Préparation des échantillons ................................................................................. 28 3.3.2. Préparation du gel polyacrylamide ........................................................................ 28 3.3.3. Chargement des protéines et électrophorèse ....................................................... 29 3.3.4. Transfert semi-humide .......................................................................................... 30 3.3.5. Incubation de la membrane avec les anticorps primaires et secondaires ............... 31 3.3.5.1. Fluorescence ................................................................................................. 31 3.3.5.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 32 3.3.6. Révélation et quantification .................................................................................. 33 3.3.6.1. Fluorescence ................................................................................................. 33 3.3.6.2. Chémiluminescence ...................................................................................... 34 3.4. PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) ...................................................................... 34 3.4.1. Principe ................................................................................................................ 34 3.4.2. Extraction d’ARN ................................................................................................... 35 3.4.3. Transcription inverse ............................................................................................ 36 3.4.4. PCR en temps réel (RT-PCR) .................................................................................. 37 3.4.5. Analyse des résultats ............................................................................................ 38 4. Résultats et discussion ......................................................................................................... 39 4.1. Détection de la protéine HIF-1α .................................................................................... 39 4.1.1. Western blot « classique » et fluorescent .............................................................. 39 4.2. Analyse de l’expression de gènes cibles de HIF-1 .......................................................... 48 4.2.1. Expression du gène SOX2 ...................................................................................... 48 4.2.2. Expression du gène NDRG1B ................................................................................. 49 Conclusions et perspectives ........................................................................................................ 51 Liste des abréviations .................................................................................................................. 53 Bibliographie ............................................................................................................................... 55 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65561

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Purification de l’enzyme PHGDH humaine et d’un mutant en vue d’une approche structurale du mode d’inhibition de cette enzyme de la voie de la sérine / Aceto Lorena

Public ISBD Titre : Purification de l’enzyme PHGDH humaine et d’un mutant en vue d’une approche structurale du mode d’inhibition de cette enzyme de la voie de la sérine Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Aceto Lorena, Auteur ; Guillaume Van Beersel, Directeur de la recherche Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  Université de Namur  laboratoire de Chimie Biologique et Structurale (CBS) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Contenu PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE 7 INTRODUCTION 8 I. CONTEXTE GÉNÉRAL 9 1. Le cancer 9 a) Epidémiologie du cancer 10 b) Caractéristiques des cellules cancéreuses 12 c) Dérégulation du métabolisme énergétique de la cellule 13 2. La voie de la sérine 15 PHGDH : la phosphoglycérate déshydrogénase 17 II. OBJECTIF ET STRATÉGIE 21 III. MATÉRIEL ET MÉTHODES 23 1. Principe: 23 Expressions de l’enzyme PHGDH du mutant et de PSAT1 : 23 La purification de l’enzyme PHGDH et du mutant 26 Détermination de la concentration protéique : 28 Electrophorèse sur gel SDS-page : 29 Tests enzymatiques : 30 Purification par chromatographie d’exclusion par la taille : 31 Cristallogenèse : 33 2. Protocoles : 34 Expression de l’enzyme PHGDH et du mutant : 34 Purification de l’enzyme PHGDH et du mutant : 35 Gel d’électrophorèse : 37 Détermination de l’activité enzymatique : 38 Chromatographie d’exclusion de taille 40 Cristallogenèse : 41 IV. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 43 Expression et purification de l’enzyme PHGDH humaine 43 Vérification de l’activité de PHGDH 46 Expression et purification de l’enzyme PSAT1 47 6 | P a g e Test d’optimisation du protocole du test enzymatique 49 Expression et purification de l’enzyme mutante 52 Purification par chromatographie d’exclusion de taille 54 Tests enzymatiques 55 Cristallogenèse 57 V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 59 BIBLIOGRAPHIE 62 ANNEXES 64 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65822 Purification de l’enzyme PHGDH humaine et d’un mutant en vue d’une approche structurale du mode d’inhibition de cette enzyme de la voie de la sérine [TFE / Mémoire] / Aceto Lorena, Auteur ; Guillaume Van Beersel, Directeur de la recherche . - 2017. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  Université de Namur  laboratoire de Chimie Biologique et Structurale (CBS) Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Note de contenu : Contenu PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE 7 INTRODUCTION 8 I. CONTEXTE GÉNÉRAL 9 1. Le cancer 9 a) Epidémiologie du cancer 10 b) Caractéristiques des cellules cancéreuses 12 c) Dérégulation du métabolisme énergétique de la cellule 13 2. La voie de la sérine 15 PHGDH : la phosphoglycérate déshydrogénase 17 II. OBJECTIF ET STRATÉGIE 21 III. MATÉRIEL ET MÉTHODES 23 1. Principe: 23 Expressions de l’enzyme PHGDH du mutant et de PSAT1 : 23 La purification de l’enzyme PHGDH et du mutant 26 Détermination de la concentration protéique : 28 Electrophorèse sur gel SDS-page : 29 Tests enzymatiques : 30 Purification par chromatographie d’exclusion par la taille : 31 Cristallogenèse : 33 2. Protocoles : 34 Expression de l’enzyme PHGDH et du mutant : 34 Purification de l’enzyme PHGDH et du mutant : 35 Gel d’électrophorèse : 37 Détermination de l’activité enzymatique : 38 Chromatographie d’exclusion de taille 40 Cristallogenèse : 41 IV. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 43 Expression et purification de l’enzyme PHGDH humaine 43 Vérification de l’activité de PHGDH 46 Expression et purification de l’enzyme PSAT1 47 6 | P a g e Test d’optimisation du protocole du test enzymatique 49 Expression et purification de l’enzyme mutante 52 Purification par chromatographie d’exclusion de taille 54 Tests enzymatiques 55 Cristallogenèse 57 V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 59 BIBLIOGRAPHIE 62 ANNEXES 64 Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65822

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