Optimalisation de la technique de quantification par RT-qPCR des ARNm sur un faible nombre de cellules / Süheda ESEN

Public ISBD Titre : Optimalisation de la technique de quantification par RT-qPCR des ARNm sur un faible nombre de cellules Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Süheda ESEN, Auteur ; Véronique Flamand, Directeur de la recherche ; Frédéric Paulart, Directeur de la recherche Année de publication : 2015 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  ULB  Institut d'immunologie médicale  IMI  Gosselies  Immunologie  Quantification par RT-qPCR Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Technique imaginée par Kary Mullis et Michael Smith en 1985 (Prix Nobel dès 1993), la réaction en chaîne par polymérase, dit PCR pour Polymerase Chain Reaction, est une technique de biologie moléculaire qui permet l’amplification en chaîne de l’ADN/l’ADNc par réplication grâce à une enzyme, la polymérase. Cette technique connait un grand essor dès la découverte de polymérases résistantes aux températures élevées, de Taq polymérases, qui ont permis l’automatisation de la technique pour l’usage en routine. L’objectif de ce travail est la détection, par amplification PCR, d’ARN dans de très faible quantité d’échantillonnage cellulaire. Pour amplifier de l’ARN par la méthode PCR, il est nécessaire de rétro-transcrire l’ARN afin obtenir l’ADNc qui sera amplifié et détecté. La quantification se fait par la détection de la fluorescence à chaque cycle. L’ensemble de cette méthodologie porte le nom de RT-qPCR pour Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction. Cette technique, très précise et sensible, fera l’objet d’une optimalisation afin de déterminer la meilleure procédure à suivre pour quantifier des profils de cytokines dans des cellules immunitaires ou des tissus enflammés à partir de très faible quantité cellulaire. Note de contenu : Table des matières Remerciements ........................................................................................................................... . Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7 Introduction ................................................................................................................................ 8 Généralités ................................................................................................................................. 8 I. Introduction à l’immunologie générale .............................................................................. 9 1.1. L’immunité naturelle / innée / native ......................................................................... 9 La barrière épithéliale ....................................................................................................... 10 Les phagocytes .................................................................................................................. 10 Les cellules NK ................................................................................................................... 11 Les médiateurs solubles .................................................................................................... 11 Les protéines du système du Complément ................................................................... 12 Les cytokines ................................................................................................................. 12 1.2. Immunité acquise / spécifique / adaptative .............................................................. 14 Les lymphocytes ................................................................................................................ 14 Les lymphocytes B ......................................................................................................... 15 Les lymphocytes T ......................................................................................................... 15 II. Processus de quantification de l’expression de gènes ..................................................... 16 2.1. Extraction de l’ARN .................................................................................................... 16 Méthode par séparation de phases .................................................................................. 16 Méthode de purification sur colonne de silice ................................................................. 17 Méthode de séparation par billes magnétiques : extraction de l’ARNm ......................... 17 Méthode de lyse cellulaire ................................................................................................ 18 2.2. Concentration, pureté et qualité de l'ARN ................................................................ 18 2.3. L’enzyme de la transcription inverse ......................................................................... 20 La rétro-transcriptase AMV............................................................................................... 20 La rétro-transcriptase M-MLV........................................................................................... 20 La rétro-transcriptase M-MuLv ......................................................................................... 21 2.4. Amorces utilisées par l’enzyme de la RT ................................................................... 21 Oligo(dT)Primers ............................................................................................................... 21 Random primers................................................................................................................ 21 Specific Primers ................................................................................................................. 21 2.5. La PCR conventionnelle ............................................................................................. 22 Principe ............................................................................................................................. 22 2.6. La PCR en temps réel ................................................................................................. 23 Principe ............................................................................................................................. 23 Système de détection en temps réel ................................................................................ 25 Agent intercalant: SYBRTM Green I ................................................................................ 25 Sonde d’hydrolyse : sondes TaqmanTM ......................................................................... 27 Les sondes FRET en tandem (sondes LightCyclerTM) ..................................................... 28 2.7. Méthode de quantification ........................................................................................ 28 Quantification absolue par étalonnage avec un standard ............................................... 29 Quantification relative par comparaison des Cq .............................................................. 29 Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 31 III. Matériel et méthodes ................................................................................................... 32 3.1. Système d’échantillonnage........................................................................................ 32 Les cellules MC38 .............................................................................................................. 32 Les cellules K-562 (ATCC) .................................................................................................. 32 Isoler les cellules CD45+ du foie murin par l’autoMACS après stimulation au LPS ............. 33 Principe de séparation MACS (Magnetic-activated cell sorting) .................................. 33 Matériel ......................................................................................................................... 33 Injection de LPS en intraveineuse ................................................................................. 34 Dissection de souris ....................................................................................................... 34 Digestion du foie ........................................................................................................... 34 Lyse des globules rouges ............................................................................................... 35 Marquage bille CD45+ .................................................................................................... 35 Séparation magnétique ................................................................................................. 35 3.2. Comptage cellulaires ................................................................................................. 36 Comptage manuel ............................................................................................................. 36 Cellule de Thoma ........................................................................................................... 36 Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ................................................ 37 Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ............................................. 37 3.3. Extraction d’ARN au TriPure et Purification sur colonne Qiagen .............................. 38 Principe d’extraction au triPure ........................................................................................ 38 Matériel ............................................................................................................................. 38 Mode opératoire ............................................................................................................... 39 Technique d’extraction ................................................................................................. 39 Technique de purification sur colonne Qiagen ............................................................. 39 3.4. Principe du NanoDrop .............................................................................................. 40 3.5. Lyse cellulaire sans extraction ................................................................................... 41 Principe ............................................................................................................................. 41 Matériel ............................................................................................................................. 41 Mode opératoire Kit Roche ............................................................................................... 41 Mode opératoire Kit Bio-Rad ............................................................................................ 42 3.6. La RT-qPCR ................................................................................................................. 43 Principe ............................................................................................................................. 43 Matériel ............................................................................................................................. 43 Mode opératoire One Step à l’aide du Kit Roche ............................................................. 44 Mode opératoire Two Steps à l’aide du Kit Bio-Rad ........................................................ 45 Préparation pour la réaction de transcription inverse ................................................. 45 Préparation de qPCR Reactions ..................................................................................... 46 IV. Résultats et discussion .................................................................................................. 47 4.1. Quantification des ARNm provenant d’une lignée cellulaire K562 ........................... 47 Comparaison des méthodes .......................................................................................... 48 Efficacité de la PCR ........................................................................................................ 52 Sources d’inefficacité des méthodes de lyse ................................................................ 54 4.2. Quantification des ARNm provenant de cellules triées ............................................ 57 Quantification de la β-actine ............................................................................................ 57 Quantification du TNF-alpha ............................................................................................. 62 Reproductibilité de la PCR One step ................................................................................. 63 Conclusion et perspectives Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64640 Optimalisation de la technique de quantification par RT-qPCR des ARNm sur un faible nombre de cellules [TFE / Mémoire] / Süheda ESEN, Auteur ; Véronique Flamand, Directeur de la recherche ; Frédéric Paulart, Directeur de la recherche . - 2015. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale  ULB  Institut d'immunologie médicale  IMI  Gosselies  Immunologie  Quantification par RT-qPCR Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Technique imaginée par Kary Mullis et Michael Smith en 1985 (Prix Nobel dès 1993), la réaction en chaîne par polymérase, dit PCR pour Polymerase Chain Reaction, est une technique de biologie moléculaire qui permet l’amplification en chaîne de l’ADN/l’ADNc par réplication grâce à une enzyme, la polymérase. Cette technique connait un grand essor dès la découverte de polymérases résistantes aux températures élevées, de Taq polymérases, qui ont permis l’automatisation de la technique pour l’usage en routine. L’objectif de ce travail est la détection, par amplification PCR, d’ARN dans de très faible quantité d’échantillonnage cellulaire. Pour amplifier de l’ARN par la méthode PCR, il est nécessaire de rétro-transcrire l’ARN afin obtenir l’ADNc qui sera amplifié et détecté. La quantification se fait par la détection de la fluorescence à chaque cycle. L’ensemble de cette méthodologie porte le nom de RT-qPCR pour Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction. Cette technique, très précise et sensible, fera l’objet d’une optimalisation afin de déterminer la meilleure procédure à suivre pour quantifier des profils de cytokines dans des cellules immunitaires ou des tissus enflammés à partir de très faible quantité cellulaire. Note de contenu : Table des matières Remerciements ........................................................................................................................... . Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 7 Introduction ................................................................................................................................ 8 Généralités ................................................................................................................................. 8 I. Introduction à l’immunologie générale .............................................................................. 9 1.1. L’immunité naturelle / innée / native ......................................................................... 9 La barrière épithéliale ....................................................................................................... 10 Les phagocytes .................................................................................................................. 10 Les cellules NK ................................................................................................................... 11 Les médiateurs solubles .................................................................................................... 11 Les protéines du système du Complément ................................................................... 12 Les cytokines ................................................................................................................. 12 1.2. Immunité acquise / spécifique / adaptative .............................................................. 14 Les lymphocytes ................................................................................................................ 14 Les lymphocytes B ......................................................................................................... 15 Les lymphocytes T ......................................................................................................... 15 II. Processus de quantification de l’expression de gènes ..................................................... 16 2.1. Extraction de l’ARN .................................................................................................... 16 Méthode par séparation de phases .................................................................................. 16 Méthode de purification sur colonne de silice ................................................................. 17 Méthode de séparation par billes magnétiques : extraction de l’ARNm ......................... 17 Méthode de lyse cellulaire ................................................................................................ 18 2.2. Concentration, pureté et qualité de l'ARN ................................................................ 18 2.3. L’enzyme de la transcription inverse ......................................................................... 20 La rétro-transcriptase AMV............................................................................................... 20 La rétro-transcriptase M-MLV........................................................................................... 20 La rétro-transcriptase M-MuLv ......................................................................................... 21 2.4. Amorces utilisées par l’enzyme de la RT ................................................................... 21 Oligo(dT)Primers ............................................................................................................... 21 Random primers................................................................................................................ 21 Specific Primers ................................................................................................................. 21 2.5. La PCR conventionnelle ............................................................................................. 22 Principe ............................................................................................................................. 22 2.6. La PCR en temps réel ................................................................................................. 23 Principe ............................................................................................................................. 23 Système de détection en temps réel ................................................................................ 25 Agent intercalant: SYBRTM Green I ................................................................................ 25 Sonde d’hydrolyse : sondes TaqmanTM ......................................................................... 27 Les sondes FRET en tandem (sondes LightCyclerTM) ..................................................... 28 2.7. Méthode de quantification ........................................................................................ 28 Quantification absolue par étalonnage avec un standard ............................................... 29 Quantification relative par comparaison des Cq .............................................................. 29 Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 31 III. Matériel et méthodes ................................................................................................... 32 3.1. Système d’échantillonnage........................................................................................ 32 Les cellules MC38 .............................................................................................................. 32 Les cellules K-562 (ATCC) .................................................................................................. 32 Isoler les cellules CD45+ du foie murin par l’autoMACS après stimulation au LPS ............. 33 Principe de séparation MACS (Magnetic-activated cell sorting) .................................. 33 Matériel ......................................................................................................................... 33 Injection de LPS en intraveineuse ................................................................................. 34 Dissection de souris ....................................................................................................... 34 Digestion du foie ........................................................................................................... 34 Lyse des globules rouges ............................................................................................... 35 Marquage bille CD45+ .................................................................................................... 35 Séparation magnétique ................................................................................................. 35 3.2. Comptage cellulaires ................................................................................................. 36 Comptage manuel ............................................................................................................. 36 Cellule de Thoma ........................................................................................................... 36 Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ................................................ 37 Comptage avec l’automate Beckman Coulter Vi-CELL XR ............................................. 37 3.3. Extraction d’ARN au TriPure et Purification sur colonne Qiagen .............................. 38 Principe d’extraction au triPure ........................................................................................ 38 Matériel ............................................................................................................................. 38 Mode opératoire ............................................................................................................... 39 Technique d’extraction ................................................................................................. 39 Technique de purification sur colonne Qiagen ............................................................. 39 3.4. Principe du NanoDrop .............................................................................................. 40 3.5. Lyse cellulaire sans extraction ................................................................................... 41 Principe ............................................................................................................................. 41 Matériel ............................................................................................................................. 41 Mode opératoire Kit Roche ............................................................................................... 41 Mode opératoire Kit Bio-Rad ............................................................................................ 42 3.6. La RT-qPCR ................................................................................................................. 43 Principe ............................................................................................................................. 43 Matériel ............................................................................................................................. 43 Mode opératoire One Step à l’aide du Kit Roche ............................................................. 44 Mode opératoire Two Steps à l’aide du Kit Bio-Rad ........................................................ 45 Préparation pour la réaction de transcription inverse ................................................. 45 Préparation de qPCR Reactions ..................................................................................... 46 IV. Résultats et discussion .................................................................................................. 47 4.1. Quantification des ARNm provenant d’une lignée cellulaire K562 ........................... 47 Comparaison des méthodes .......................................................................................... 48 Efficacité de la PCR ........................................................................................................ 52 Sources d’inefficacité des méthodes de lyse ................................................................ 54 4.2. Quantification des ARNm provenant de cellules triées ............................................ 57 Quantification de la β-actine ............................................................................................ 57 Quantification du TNF-alpha ............................................................................................. 62 Reproductibilité de la PCR One step ................................................................................. 63 Conclusion et perspectives Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=64640

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