| Titre : |
Évaluation de méthodes pour la détection d’organismes modifiés par les nouvelles techniques d’édition de génome |
| Type de document : |
TFE / Mémoire |
| Auteurs : |
Ludovic Nicolay, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef |
| Editeur : |
Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie |
| Année de publication : |
2023 |
| Note générale : |
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur |
| Langues : |
Français (fre) |
| Index. décimale : |
TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies |
| Résumé : |
Au cours de cette dernière décennie, la modification génétique des organismes a été révolutionnée par de nouvelles techniques d'édition du génome, comme les Transcription Activator- Like Effector Nucleases (TALENs) et Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR-Cas9). L'essor de ces technologies a soulevé de nouveaux défis en matière de réglementation et de détection. Dans ce contexte complexe et en pleine évolution, le projet GenEdit, coordonné par le CRA-W et financé par le SPF Santé Publique et Sécurité de la chaîne alimentaire et Environnement, vise à développer et à évaluer des approches pour la détection d'organismes génétiquement modifiés par les nouvelles techniques d'édition du génome.
L'objectif de ce projet de fin d'études a été de développer et d'évaluer trois méthodes basées sur l’analyse de l'ADN en travaillant avec des séquences ADN plasmidiques non-mutantes et mutantes présentant des modifications de l’ordre d’un à deux nucléotide(s). Les trois différentes méthodes sont la PCR en temps réel, la PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), et la technique HRM (High Resolution Melting). La PCR en temps réel
est la méthode la plus largement utilisée dans la détection des organismes génétiquement modifiés. Elle a été étudiée en utilisant des sondes modifiées (LNA ou MGB) ayant pour but d’améliorer la spécificité des tests. Cependant, Les résultats obtenus ont montré que la sensibilité est le seul critère de performance qui a été atteint pour les séquences testées. Les critères de spécificité et d'efficience n'ont été satisfaits que pour un nombre limité de
séquences, ce qui indique que cette méthode nécessite des améliorations. De plus, les résultats obtenus ont montré des différences en fonction des appareils utilisés. La HRM est une méthode initialement utilisée pour détecter des mutations au sein des individus en analysant les pics de fusion des échantillons. Cette technique a d’abord été étudiée pour qu’elle permettait bien une distinction des séquences et les résultats ont été concluants.
Cependant, le critère de sensibilité de la méthode n’a pas être atteint. La méthode PCR-RFLP est à la base utilisée pour détecter des variations génétiques, en exploitant les différences dans les sites de coupure des enzymes de restriction. La technique a été évaluée afin d’examiner sa capacité à différencier une séquence non mutante d’une séquence mutante portant une modification d’un nucléotide et les résultats ont été positifs. Cependant, le
critère de sensibilité n’a pas été atteint.
Une évaluation de ces méthodes sur de ADN génomique serait nécessaire pour confirmer ces premières observations sur ADN plasmidique. Des analyses sur ADN génomique pourraient être certes plus complexes mais correspondraient à une situation plus réelle. De plus, un travail sur ADN génomique laisserait supposer un risque moins accru de contaminations |
| Note de contenu : |
Table des matières
Introduction générale ........................................................................................................................ 6
I. Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 8
II. Introduction bibliographique...................................................................................................... 9
1. Introduction aux organismes génétiquement modifiés ............................................................... 9
1.1. Définition d’un organisme génétiquement modifié ............................................................. 9
2. Nouvelles techniques d'édition du génome ................................................................................ 9
2.1. CRISPR/Cas9 : ....................................................................................................................10
2.2. TALENs ..............................................................................................................................11
3. Applications des nouvelles méthodes d’édition du génome dans l’agronomie ...........................12
3.1. Résistance aux maladies ....................................................................................................12
3.2. Tolérance à la sécheresse et au stress environnemental ....................................................13
3.3. Tolérance aux herbicides ...................................................................................................14
3.4. Amélioration de la qualité nutritionnelle ...........................................................................14
4. Risques liés aux OGM ................................................................................................................15
4.1. Risques environnementaux................................................................................................15
4.2. Risques pour la santé humaine ..........................................................................................15
5. Législation européenne sur les OGM .........................................................................................16
5.1. Mise sur le marché des OGM et dissémination volontaire d'organismes génétiquement
modifiés........................................................................................................................................17
5.2. Étiquetage .........................................................................................................................17
6. Techniques actuelles de détection d’OGM ................................................................................18
6.1. La réaction de polymérisation en chaine (PCR)...................................................................18
6.2. La PCR en temps réel (qPCR) ..............................................................................................21
6.3. La PCR digitale (dPCR) ........................................................................................................22
6.4. La Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) ...23
6.5. La High-Resolution Melting Analysis (HRM)........................................................................24
6.6. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) ....................................................................24
III. Objectifs et stratégies ...............................................................................................................26
IV. Matériel et méthodes ...............................................................................................................27
1. Préparation des plasmides contenant les séquences ADN d’intérêt ...........................................27
1.1. Construction des séquences ..............................................................................................27
1.1.1. Construction des séquences pour le colza ..................................................................27
1.1.2. Construction des séquences pour le soja ....................................................................27
1.2. Réalisation de la PCR .........................................................................................................28
1.3. Réalisation du clonage .......................................................................................................29
1.4. Transformation des bactéries compétentes .......................................................................30
1.5. Extraction des plasmides ...................................................................................................31
1.6. Digestion des plasmides ....................................................................................................32
1.7. Purification des plasmides linéarisés ..................................................................................32
2. Quantification et évaluation de la qualité de l’ADN extrait ........................................................33
3. Dilutions des solutions de plasmides .........................................................................................33
4. Analyse d’ADN par PCR en temps réel .......................................................................................34
4.1. Préparation et réalisation de la PCR en temps réel.............................................................34
4.1.1. Amorces et sondes utilisées .......................................................................................35
5. Analyse d’ADN par HRM (High Resolution Melt) ........................................................................37
5.1. Réactifs et conditions de la HRM .......................................................................................37
6. Analyse d’ADN par PCR-RFLP .....................................................................................................37
6.1. Réalisation de la PCR .........................................................................................................37
6.2. Digestion des produits PCR ................................................................................................38
V. Résultats et discussion ..............................................................................................................39
1. Construction des séquences pour le colza .................................................................................39
1.1. Résultats obtenus ..............................................................................................................39
1.2. Interprétation ....................................................................................................................39
1.3. Résultats de la transformation des bactéries .....................................................................40
2. Analyse d’ADN par PCR en temps réel .......................................................................................41
2.1. Évaluation des critères de performances ...........................................................................41
2.1.1. Critère de spécificité ..................................................................................................41
2.1.2. Critère d’efficience.....................................................................................................49
2.1.3. Critère de sensibilité ..................................................................................................52
2.2. Conclusion .........................................................................................................................53
3. Analyse d’ADN par HRM ............................................................................................................54
3.1. Résultats obtenus ..............................................................................................................54
3.1.1. Test de spécificité ......................................................................................................54
3.1.2. Test de sensibilité sur les séquences lectine WT et lectine-C ......................................55
3.1.3. Test de sensibilité sur les différents mélanges en lectine WT et lectine-C ...................56
3.1.4. Test de sensibilité sur les différents mélanges en Canola WT et Cibus mutant ............57
3.2. Conclusion .........................................................................................................................58
4. Analyse d’ADN par PCR-RFLP .....................................................................................................59
4.1. Résultats obtenus ..............................................................................................................59
4.1.1. Analyse sur des concentrations différentes de Canola WT et Cibus mutant ................59
4.1.2. Analyse sur des mélanges en Canola WT et Cibus mutant ..........................................60
4.2. Conclusion .........................................................................................................................62
Conclusion et perspectives................................................................................................................63
VI. Liste des Abréviations ...............................................................................................................65
VII. Liste des Illustrations.................................................................................................................67
VIII. Liste des Tableaux .....................................................................................................................68
Bibliographie ....................................................................................................................................69
1. Revues scientifiques ..........................................................................................................69
2. Livres .................................................................................................................................83
3. Sites Web ..........................................................................................................................83
Table des annexes.............................................................................................................................85
Annexes ............................................................................................................................................87
|
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Évaluation de méthodes pour la détection d’organismes modifiés par les nouvelles techniques d’édition de génome [TFE / Mémoire] / Ludovic Nicolay, Auteur ; Jonathan Scauflaire, Directeur de publication, rédacteur en chef . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Agronomie, 2023. Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français ( fre)
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TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies |
| Résumé : |
Au cours de cette dernière décennie, la modification génétique des organismes a été révolutionnée par de nouvelles techniques d'édition du génome, comme les Transcription Activator- Like Effector Nucleases (TALENs) et Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR-Cas9). L'essor de ces technologies a soulevé de nouveaux défis en matière de réglementation et de détection. Dans ce contexte complexe et en pleine évolution, le projet GenEdit, coordonné par le CRA-W et financé par le SPF Santé Publique et Sécurité de la chaîne alimentaire et Environnement, vise à développer et à évaluer des approches pour la détection d'organismes génétiquement modifiés par les nouvelles techniques d'édition du génome.
L'objectif de ce projet de fin d'études a été de développer et d'évaluer trois méthodes basées sur l’analyse de l'ADN en travaillant avec des séquences ADN plasmidiques non-mutantes et mutantes présentant des modifications de l’ordre d’un à deux nucléotide(s). Les trois différentes méthodes sont la PCR en temps réel, la PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), et la technique HRM (High Resolution Melting). La PCR en temps réel
est la méthode la plus largement utilisée dans la détection des organismes génétiquement modifiés. Elle a été étudiée en utilisant des sondes modifiées (LNA ou MGB) ayant pour but d’améliorer la spécificité des tests. Cependant, Les résultats obtenus ont montré que la sensibilité est le seul critère de performance qui a été atteint pour les séquences testées. Les critères de spécificité et d'efficience n'ont été satisfaits que pour un nombre limité de
séquences, ce qui indique que cette méthode nécessite des améliorations. De plus, les résultats obtenus ont montré des différences en fonction des appareils utilisés. La HRM est une méthode initialement utilisée pour détecter des mutations au sein des individus en analysant les pics de fusion des échantillons. Cette technique a d’abord été étudiée pour qu’elle permettait bien une distinction des séquences et les résultats ont été concluants.
Cependant, le critère de sensibilité de la méthode n’a pas être atteint. La méthode PCR-RFLP est à la base utilisée pour détecter des variations génétiques, en exploitant les différences dans les sites de coupure des enzymes de restriction. La technique a été évaluée afin d’examiner sa capacité à différencier une séquence non mutante d’une séquence mutante portant une modification d’un nucléotide et les résultats ont été positifs. Cependant, le
critère de sensibilité n’a pas été atteint.
Une évaluation de ces méthodes sur de ADN génomique serait nécessaire pour confirmer ces premières observations sur ADN plasmidique. Des analyses sur ADN génomique pourraient être certes plus complexes mais correspondraient à une situation plus réelle. De plus, un travail sur ADN génomique laisserait supposer un risque moins accru de contaminations |
| Note de contenu : |
Table des matières
Introduction générale ........................................................................................................................ 6
I. Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 8
II. Introduction bibliographique...................................................................................................... 9
1. Introduction aux organismes génétiquement modifiés ............................................................... 9
1.1. Définition d’un organisme génétiquement modifié ............................................................. 9
2. Nouvelles techniques d'édition du génome ................................................................................ 9
2.1. CRISPR/Cas9 : ....................................................................................................................10
2.2. TALENs ..............................................................................................................................11
3. Applications des nouvelles méthodes d’édition du génome dans l’agronomie ...........................12
3.1. Résistance aux maladies ....................................................................................................12
3.2. Tolérance à la sécheresse et au stress environnemental ....................................................13
3.3. Tolérance aux herbicides ...................................................................................................14
3.4. Amélioration de la qualité nutritionnelle ...........................................................................14
4. Risques liés aux OGM ................................................................................................................15
4.1. Risques environnementaux................................................................................................15
4.2. Risques pour la santé humaine ..........................................................................................15
5. Législation européenne sur les OGM .........................................................................................16
5.1. Mise sur le marché des OGM et dissémination volontaire d'organismes génétiquement
modifiés........................................................................................................................................17
5.2. Étiquetage .........................................................................................................................17
6. Techniques actuelles de détection d’OGM ................................................................................18
6.1. La réaction de polymérisation en chaine (PCR)...................................................................18
6.2. La PCR en temps réel (qPCR) ..............................................................................................21
6.3. La PCR digitale (dPCR) ........................................................................................................22
6.4. La Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) ...23
6.5. La High-Resolution Melting Analysis (HRM)........................................................................24
6.6. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) ....................................................................24
III. Objectifs et stratégies ...............................................................................................................26
IV. Matériel et méthodes ...............................................................................................................27
1. Préparation des plasmides contenant les séquences ADN d’intérêt ...........................................27
1.1. Construction des séquences ..............................................................................................27
1.1.1. Construction des séquences pour le colza ..................................................................27
1.1.2. Construction des séquences pour le soja ....................................................................27
1.2. Réalisation de la PCR .........................................................................................................28
1.3. Réalisation du clonage .......................................................................................................29
1.4. Transformation des bactéries compétentes .......................................................................30
1.5. Extraction des plasmides ...................................................................................................31
1.6. Digestion des plasmides ....................................................................................................32
1.7. Purification des plasmides linéarisés ..................................................................................32
2. Quantification et évaluation de la qualité de l’ADN extrait ........................................................33
3. Dilutions des solutions de plasmides .........................................................................................33
4. Analyse d’ADN par PCR en temps réel .......................................................................................34
4.1. Préparation et réalisation de la PCR en temps réel.............................................................34
4.1.1. Amorces et sondes utilisées .......................................................................................35
5. Analyse d’ADN par HRM (High Resolution Melt) ........................................................................37
5.1. Réactifs et conditions de la HRM .......................................................................................37
6. Analyse d’ADN par PCR-RFLP .....................................................................................................37
6.1. Réalisation de la PCR .........................................................................................................37
6.2. Digestion des produits PCR ................................................................................................38
V. Résultats et discussion ..............................................................................................................39
1. Construction des séquences pour le colza .................................................................................39
1.1. Résultats obtenus ..............................................................................................................39
1.2. Interprétation ....................................................................................................................39
1.3. Résultats de la transformation des bactéries .....................................................................40
2. Analyse d’ADN par PCR en temps réel .......................................................................................41
2.1. Évaluation des critères de performances ...........................................................................41
2.1.1. Critère de spécificité ..................................................................................................41
2.1.2. Critère d’efficience.....................................................................................................49
2.1.3. Critère de sensibilité ..................................................................................................52
2.2. Conclusion .........................................................................................................................53
3. Analyse d’ADN par HRM ............................................................................................................54
3.1. Résultats obtenus ..............................................................................................................54
3.1.1. Test de spécificité ......................................................................................................54
3.1.2. Test de sensibilité sur les séquences lectine WT et lectine-C ......................................55
3.1.3. Test de sensibilité sur les différents mélanges en lectine WT et lectine-C ...................56
3.1.4. Test de sensibilité sur les différents mélanges en Canola WT et Cibus mutant ............57
3.2. Conclusion .........................................................................................................................58
4. Analyse d’ADN par PCR-RFLP .....................................................................................................59
4.1. Résultats obtenus ..............................................................................................................59
4.1.1. Analyse sur des concentrations différentes de Canola WT et Cibus mutant ................59
4.1.2. Analyse sur des mélanges en Canola WT et Cibus mutant ..........................................60
4.2. Conclusion .........................................................................................................................62
Conclusion et perspectives................................................................................................................63
VI. Liste des Abréviations ...............................................................................................................65
VII. Liste des Illustrations.................................................................................................................67
VIII. Liste des Tableaux .....................................................................................................................68
Bibliographie ....................................................................................................................................69
1. Revues scientifiques ..........................................................................................................69
2. Livres .................................................................................................................................83
3. Sites Web ..........................................................................................................................83
Table des annexes.............................................................................................................................85
Annexes ............................................................................................................................................87
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Évaluation de méthodes pour la détection d’organismes modifiés par les nouvelles techniques d’édition de génome
