Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
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Mercredi 9h-16h30
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Votre centre de documentation sera fermé du 28 octobre au 3 novembre
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Mise au point de constructions génétiques en vue de l’étude du développement des trichomes glandulaires de Nicotiana / SIMON TRIGALET
Titre : Mise au point de constructions génétiques en vue de l’étude du développement des trichomes glandulaires de Nicotiana Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : SIMON TRIGALET, Auteur ; Julie Schmitz, Directeur de publication, rédacteur en chef Année de publication : 2017 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Agronomie AIBT UCL ISV Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : Les trichomes sont des structures dérivées du protoderme qui se développent à la
surface des parties aériennes des plantes (tiges, feuilles, fleurs). Plus de 300 critères
différents existent pour les classifier. Ces excroissances remplissent plusieurs fonctions : la
sécrétion de composés, la protection contre les insectes phytophages ou encore la
production de substances volatiles. Le but de ce travail est d’identifier les gènes impliqués
dans le développement des trichomes chez l’espèce Nicotiana tabacum, qui sont pour
l’instant encore inconnus. Pour ce faire deux constructions génétiques ont été abordées ;
premièrement une construction de RNA silencing visant les gènes NtTIP2;1, NtYODA et
NtHEC2 et dans un second temps un rapporteur transcriptionnel visant les gènes NtYODA et
NtCNR13.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage .................................................................................................................. 9
Introduction ........................................................................................................................................... 11
1. Partie théorique ............................................................................................................................ 12
1.1. Nicotiana tabacum ................................................................................................................ 12
1.2. Rôle des trichomes ................................................................................................................ 14
1.3. Développement des trichomes ............................................................................................. 15
1.3.1. Mécanisme d’initiation et développement des trichomes chez Arabidopsis thaliana ... 15
1.3.2. Mécanisme d’inhibition et régulation du nombre de trichomes .................................... 17
1.3.3. Influence de la surexpression de MIXTA et GL1 chez Nicotiana tabacum ...................... 17
1.4. Constructions génétiques abordées ...................................................................................... 19
1.4.1. RNA silencing ou interférence ARN : un mécanisme de régulation posttranscriptionnelle
.......................................................................................................................... 19
1.4.2. Rapporteur transcriptionnel ............................................................................................ 20
1.5. Gènes visés : choix et fonction .............................................................................................. 21
2. Partie pratique ............................................................................................................................... 23
2.1. Objectif .................................................................................................................................. 23
2.2. Matériel et manipulations ..................................................................................................... 24
2.2.1. Stérilisation de graines .................................................................................................... 24
2.2.2. La PCR .............................................................................................................................. 24
2.2.3. Gel d’agarose ................................................................................................................... 25
2.2.4. Purification de produit PCR ............................................................................................. 25
2.2.5. Quantification de l’ADN ................................................................................................... 26
2.2.6. GATEWAY cloning ............................................................................................................ 26
2.2.6.1. Clonage directionnel dans pENTRTM/D-TOPOR ...................................................... 26
2.2.6.2. réaction LR et BP ................................................................................................... 27
2.2.1. Transformation d’Escherichia coli. .................................................................................. 28
2.2.1.1. Transformation par heat-shock ............................................................................. 28
2.2.1.2. Transformation par électroporation ..................................................................... 29
2.2.2. Minipréparation d’ADN plasmidique ............................................................................... 29
2.2.3. Restriction ........................................................................................................................ 30
2.2.4. Milieux ............................................................................................................................. 31
2.2.4.1. MS .......................................................................................................................... 31
2.2.4.2. Le milieu de culture LB .......................................................................................... 31
2.2.5. Séquençage ...................................................................................................................... 31
2.2.6. Déphosphorylation .......................................................................................................... 32
2.2.7. Ligation T4 ....................................................................................................................... 32
2.3. Mode opératoire ................................................................................................................... 33
2.3.1. RNA silencing ................................................................................................................... 33
2.3.1.1. Amplification PCR .................................................................................................. 34
2.3.1.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 34
2.3.1.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 35
2.3.1.4. Insertion dans Agrobacterium tumefaciens .......................................................... 36
2.3.1.5. Transformation de plantes .................................................................................... 36
2.3.2. Rapporteur transcriptionnel ............................................................................................ 37
2.3.2.1. Amplification PCR .................................................................................................. 37
2.3.2.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 38
2.3.2.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 38
2.4. Résultats ................................................................................................................................ 39
2.4.1. RNA silencing ................................................................................................................... 39
2.4.1.1. Amplification par PCR ............................................................................................ 39
2.4.1.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 40
2.4.1.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 42
2.4.1.4. Insertion dans un vecteur d’expression sous contrôle d’un promoteur ............... 43
2.4.1.5. Insertion dans A. tumefaciens ............................................................................... 43
2.4.1.6. Transformation de plantes .................................................................................... 44
2.4.2. Rapporteur transcriptionnel ............................................................................................ 44
2.4.2.1. Amplification PCR .................................................................................................. 45
2.4.2.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 45
2.4.2.2.1. NtYODA ............................................................................................................... 45
2.4.2.2.2. NtCNR13 ............................................................................................................. 46
2.4.2.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 47
2.4.2.4. Insertion dans Agrobactérium tumefaciens .......................................................... 48
2.4.2.5. Transformation des plantes................................................................................... 48
Conclusion et perspectives ................................................................................................................ 49
Bibliographie.......................................................................................................................................... 54
Annexes ................................................................................................................................................. 56
1. PCR ............................................................................................................................................. 56
2. Gel d’agarose ............................................................................................................................. 58
3. Purification PCR ......................................................................................................................... 58
4. E.coli électro-compétente ......................................................................................................... 58
5. Miniprep .................................................................................................................................... 59
6. Restriction ................................................................................................................................. 60
7. Préparation de milieux .............................................................................................................. 60
7.1. Milieu Murashige et Skoog (MS) ..................................................................................... 60
7.2. Milieu lysogeny broth (LB) ............................................................................................... 61
8. Miniprep A.thuméfaciens .............................................................................................................. 61
9. Transformation de plantes ............................................................................................................ 62
10. Agrobacterium tumefaciens compétente ................................................................................... 62
11.Cartes des vecteurs ...................................................................................................................... 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65886 Mise au point de constructions génétiques en vue de l’étude du développement des trichomes glandulaires de Nicotiana [TFE / Mémoire] / SIMON TRIGALET, Auteur ; Julie Schmitz, Directeur de publication, rédacteur en chef . - 2017.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : Agronomie AIBT UCL ISV Index. décimale : TFE AIBT TFE Agro-industries et biotechnologies Résumé : Les trichomes sont des structures dérivées du protoderme qui se développent à la
surface des parties aériennes des plantes (tiges, feuilles, fleurs). Plus de 300 critères
différents existent pour les classifier. Ces excroissances remplissent plusieurs fonctions : la
sécrétion de composés, la protection contre les insectes phytophages ou encore la
production de substances volatiles. Le but de ce travail est d’identifier les gènes impliqués
dans le développement des trichomes chez l’espèce Nicotiana tabacum, qui sont pour
l’instant encore inconnus. Pour ce faire deux constructions génétiques ont été abordées ;
premièrement une construction de RNA silencing visant les gènes NtTIP2;1, NtYODA et
NtHEC2 et dans un second temps un rapporteur transcriptionnel visant les gènes NtYODA et
NtCNR13.Note de contenu : Table des matières
Présentation du lieu de stage .................................................................................................................. 9
Introduction ........................................................................................................................................... 11
1. Partie théorique ............................................................................................................................ 12
1.1. Nicotiana tabacum ................................................................................................................ 12
1.2. Rôle des trichomes ................................................................................................................ 14
1.3. Développement des trichomes ............................................................................................. 15
1.3.1. Mécanisme d’initiation et développement des trichomes chez Arabidopsis thaliana ... 15
1.3.2. Mécanisme d’inhibition et régulation du nombre de trichomes .................................... 17
1.3.3. Influence de la surexpression de MIXTA et GL1 chez Nicotiana tabacum ...................... 17
1.4. Constructions génétiques abordées ...................................................................................... 19
1.4.1. RNA silencing ou interférence ARN : un mécanisme de régulation posttranscriptionnelle
.......................................................................................................................... 19
1.4.2. Rapporteur transcriptionnel ............................................................................................ 20
1.5. Gènes visés : choix et fonction .............................................................................................. 21
2. Partie pratique ............................................................................................................................... 23
2.1. Objectif .................................................................................................................................. 23
2.2. Matériel et manipulations ..................................................................................................... 24
2.2.1. Stérilisation de graines .................................................................................................... 24
2.2.2. La PCR .............................................................................................................................. 24
2.2.3. Gel d’agarose ................................................................................................................... 25
2.2.4. Purification de produit PCR ............................................................................................. 25
2.2.5. Quantification de l’ADN ................................................................................................... 26
2.2.6. GATEWAY cloning ............................................................................................................ 26
2.2.6.1. Clonage directionnel dans pENTRTM/D-TOPOR ...................................................... 26
2.2.6.2. réaction LR et BP ................................................................................................... 27
2.2.1. Transformation d’Escherichia coli. .................................................................................. 28
2.2.1.1. Transformation par heat-shock ............................................................................. 28
2.2.1.2. Transformation par électroporation ..................................................................... 29
2.2.2. Minipréparation d’ADN plasmidique ............................................................................... 29
2.2.3. Restriction ........................................................................................................................ 30
2.2.4. Milieux ............................................................................................................................. 31
2.2.4.1. MS .......................................................................................................................... 31
2.2.4.2. Le milieu de culture LB .......................................................................................... 31
2.2.5. Séquençage ...................................................................................................................... 31
2.2.6. Déphosphorylation .......................................................................................................... 32
2.2.7. Ligation T4 ....................................................................................................................... 32
2.3. Mode opératoire ................................................................................................................... 33
2.3.1. RNA silencing ................................................................................................................... 33
2.3.1.1. Amplification PCR .................................................................................................. 34
2.3.1.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 34
2.3.1.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 35
2.3.1.4. Insertion dans Agrobacterium tumefaciens .......................................................... 36
2.3.1.5. Transformation de plantes .................................................................................... 36
2.3.2. Rapporteur transcriptionnel ............................................................................................ 37
2.3.2.1. Amplification PCR .................................................................................................. 37
2.3.2.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 38
2.3.2.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 38
2.4. Résultats ................................................................................................................................ 39
2.4.1. RNA silencing ................................................................................................................... 39
2.4.1.1. Amplification par PCR ............................................................................................ 39
2.4.1.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 40
2.4.1.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 42
2.4.1.4. Insertion dans un vecteur d’expression sous contrôle d’un promoteur ............... 43
2.4.1.5. Insertion dans A. tumefaciens ............................................................................... 43
2.4.1.6. Transformation de plantes .................................................................................... 44
2.4.2. Rapporteur transcriptionnel ............................................................................................ 44
2.4.2.1. Amplification PCR .................................................................................................. 45
2.4.2.2. Insertion dans un vecteur d’entrée ....................................................................... 45
2.4.2.2.1. NtYODA ............................................................................................................... 45
2.4.2.2.2. NtCNR13 ............................................................................................................. 46
2.4.2.3. Insertion dans un vecteur d’expression ................................................................ 47
2.4.2.4. Insertion dans Agrobactérium tumefaciens .......................................................... 48
2.4.2.5. Transformation des plantes................................................................................... 48
Conclusion et perspectives ................................................................................................................ 49
Bibliographie.......................................................................................................................................... 54
Annexes ................................................................................................................................................. 56
1. PCR ............................................................................................................................................. 56
2. Gel d’agarose ............................................................................................................................. 58
3. Purification PCR ......................................................................................................................... 58
4. E.coli électro-compétente ......................................................................................................... 58
5. Miniprep .................................................................................................................................... 59
6. Restriction ................................................................................................................................. 60
7. Préparation de milieux .............................................................................................................. 60
7.1. Milieu Murashige et Skoog (MS) ..................................................................................... 60
7.2. Milieu lysogeny broth (LB) ............................................................................................... 61
8. Miniprep A.thuméfaciens .............................................................................................................. 61
9. Transformation de plantes ............................................................................................................ 62
10. Agrobacterium tumefaciens compétente ................................................................................... 62
11.Cartes des vecteurs ...................................................................................................................... 64Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=65886 Exemplaires
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