Centre de Documentation Campus Montignies
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Lundi : 8h-18h30
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Mercredi 9h-16h30
Jeudi : 8h-18h30
Vendredi : 8h-16h30
Attention, votre centre de documentation sera fermé du 27/04 au 12/05 inclus.
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Helha. Paramédical - Biologie médicale
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La procalcitonine, un marqueur incontournable en 2019 ? Le point de vue d’un hôpital périphérique / Lucie Cariaux
Titre : La procalcitonine, un marqueur incontournable en 2019 ? Le point de vue d’un hôpital périphérique Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Lucie Cariaux, Auteur ; Luc Blockx, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale CNDG Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La procalcitonine est une protéine sécrétée en réponse à une inflammation systémique sévère, en particulier bactérienne. Sa cinétique rapide et son court temps de demi-vie lui permettent de jouer un rôle dans le diagnostic de sepsis, l’initiation et le suivi de l’antibiothérapie qui en découle, mais également dans la prise en charge des patients BPCO en exacerbation aiguë.
Dans cette étude menée à la Clinique Notre-Dame de Grâce, le dosage de la PCT a été réalisé sur deux automates différents : le Mini Vidas et l’Atellica. Le Mini Vidas utilise le principe immunoenzymatique de type sandwich avec une détection finale en fluorescence. L’Atellica fait appel à un immunodosage de type sandwich basé sur le principe de chimiluminescence.
Nous avons vérifié qu’il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre ces deux méthodes de dosage, qui présentent une supériorité en termes de spécificité et de sensibilité par rapport à la CRP pour le diagnostic de sepsis.
Les algorithmes proposés par le laboratoire ont permis de guider le clinicien dans la prise en charge du patient septique et en particulier le monitoring de l’antibiothérapie.
Le dosage de la PCT a également permis d’identifier une cause bactérienne aux exacerbations aiguës chez des patients BPCO, sur un échantillonnage plus restreint.
Les conclusions de notre étude confirment l’efficacité de la PCT pour ces trois indications. Cependant, son dosage n’est pas encore réalisé en routine à la CNDG. L’une des explications possibles pourrait être le non-remboursement de ce test onéreux.Note de contenu : Remerciements
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 6
Introduction générale................................................................................................................. 7
Contexte général ........................................................................................................................ 8
1. Biomarqueurs sanguins de l’inflammation .................................................................... 8
1.1 Vitesse de sédimentation ........................................................................................ 8
1.2 Protéine C-réactive .................................................................................................. 9
1.2.1 Structure ........................................................................................................... 9
1.2.2 Origine .............................................................................................................. 9
1.2.3 Cinétique ........................................................................................................... 9
1.2.4 Avantages ....................................................................................................... 10
1.2.5 Inconvénients ................................................................................................. 10
1.3 Interleukine-6 ......................................................................................................... 10
1.4 TNF-α ...................................................................................................................... 11
2. Procalcitonine ............................................................................................................... 11
2.1 Structure ................................................................................................................ 11
2.2 Origine .................................................................................................................... 12
2.3 Rôle physiopathologique ....................................................................................... 13
2.4 Cinétique ................................................................................................................ 13
2.5 Dosage .................................................................................................................... 14
2.5.1 Méthode semi-quantitative ............................................................................ 14
2.5.2 Méthode quantitative .................................................................................... 15
2.6 Applications cliniques ............................................................................................ 15
2.6.1 PCT et sepsis ................................................................................................... 15
2.6.2 PCT et BPCO .................................................................................................... 18
2.6.3 PCT et méningite............................................................................................. 20
2.6.4 Autres causes influençant la concentration de PCT ....................................... 21
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 22
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 23
1. Echantillon .................................................................................................................... 23
1.1 Mini Vidas ............................................................................................................... 23
1.2 Atellica .................................................................................................................... 23
1.3 Préparation des échantillons ................................................................................. 23
2. Mini Vidas ..................................................................................................................... 24
2.1 Principe .................................................................................................................. 24
2.2 Matériel .................................................................................................................. 25
2.3 Méthode ................................................................................................................. 26
2.3.1 Calibration ...................................................................................................... 26
2.3.2 Protocole......................................................................................................... 26
3. Atellica .......................................................................................................................... 27
3.1 Principe .................................................................................................................. 27
3.2 Matériel .................................................................................................................. 28
3.3 Méthode ................................................................................................................. 28
3.3.1 Calibration ...................................................................................................... 28
3.3.2 Protocole......................................................................................................... 29
4. Algorithmes .................................................................................................................. 30
4.1 Diagnostic sepsis .................................................................................................... 30
4.2 Suivi de l’antibiothérapie ....................................................................................... 31
4.3 Diagnostic et initiation antibiothérapie des BPCO ................................................ 32
Résultats et discussions ............................................................................................................ 33
1. Diagnostic sepsis .......................................................................................................... 33
1.1 Description population .......................................................................................... 33
1.2 Comparaison de méthodes .................................................................................... 34
1.3 Interprétation des résultats de PCT sur le Mini Vidas ........................................... 36
1.3.1 Les vrais positifs .............................................................................................. 37
1.3.2 Les vrais négatifs ............................................................................................. 38
1.3.3 Les cas discordants ......................................................................................... 39
2. Suivi antibiothérapie .................................................................................................... 40
3. Diagnostic BPCO ........................................................................................................... 42
Conclusions ............................................................................................................................... 43
Liste des tableaux et liste des figures ....................................................................................... 44
Bibliographie ............................................................................................................................ 46
Annexes
6Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79985 La procalcitonine, un marqueur incontournable en 2019 ? Le point de vue d’un hôpital périphérique [TFE / Mémoire] / Lucie Cariaux, Auteur ; Luc Blockx, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur.
Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale CNDG Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La procalcitonine est une protéine sécrétée en réponse à une inflammation systémique sévère, en particulier bactérienne. Sa cinétique rapide et son court temps de demi-vie lui permettent de jouer un rôle dans le diagnostic de sepsis, l’initiation et le suivi de l’antibiothérapie qui en découle, mais également dans la prise en charge des patients BPCO en exacerbation aiguë.
Dans cette étude menée à la Clinique Notre-Dame de Grâce, le dosage de la PCT a été réalisé sur deux automates différents : le Mini Vidas et l’Atellica. Le Mini Vidas utilise le principe immunoenzymatique de type sandwich avec une détection finale en fluorescence. L’Atellica fait appel à un immunodosage de type sandwich basé sur le principe de chimiluminescence.
Nous avons vérifié qu’il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre ces deux méthodes de dosage, qui présentent une supériorité en termes de spécificité et de sensibilité par rapport à la CRP pour le diagnostic de sepsis.
Les algorithmes proposés par le laboratoire ont permis de guider le clinicien dans la prise en charge du patient septique et en particulier le monitoring de l’antibiothérapie.
Le dosage de la PCT a également permis d’identifier une cause bactérienne aux exacerbations aiguës chez des patients BPCO, sur un échantillonnage plus restreint.
Les conclusions de notre étude confirment l’efficacité de la PCT pour ces trois indications. Cependant, son dosage n’est pas encore réalisé en routine à la CNDG. L’une des explications possibles pourrait être le non-remboursement de ce test onéreux.Note de contenu : Remerciements
Présentation du lieu de stage ..................................................................................................... 6
Introduction générale................................................................................................................. 7
Contexte général ........................................................................................................................ 8
1. Biomarqueurs sanguins de l’inflammation .................................................................... 8
1.1 Vitesse de sédimentation ........................................................................................ 8
1.2 Protéine C-réactive .................................................................................................. 9
1.2.1 Structure ........................................................................................................... 9
1.2.2 Origine .............................................................................................................. 9
1.2.3 Cinétique ........................................................................................................... 9
1.2.4 Avantages ....................................................................................................... 10
1.2.5 Inconvénients ................................................................................................. 10
1.3 Interleukine-6 ......................................................................................................... 10
1.4 TNF-α ...................................................................................................................... 11
2. Procalcitonine ............................................................................................................... 11
2.1 Structure ................................................................................................................ 11
2.2 Origine .................................................................................................................... 12
2.3 Rôle physiopathologique ....................................................................................... 13
2.4 Cinétique ................................................................................................................ 13
2.5 Dosage .................................................................................................................... 14
2.5.1 Méthode semi-quantitative ............................................................................ 14
2.5.2 Méthode quantitative .................................................................................... 15
2.6 Applications cliniques ............................................................................................ 15
2.6.1 PCT et sepsis ................................................................................................... 15
2.6.2 PCT et BPCO .................................................................................................... 18
2.6.3 PCT et méningite............................................................................................. 20
2.6.4 Autres causes influençant la concentration de PCT ....................................... 21
Objectifs et stratégie ................................................................................................................ 22
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 23
1. Echantillon .................................................................................................................... 23
1.1 Mini Vidas ............................................................................................................... 23
1.2 Atellica .................................................................................................................... 23
1.3 Préparation des échantillons ................................................................................. 23
2. Mini Vidas ..................................................................................................................... 24
2.1 Principe .................................................................................................................. 24
2.2 Matériel .................................................................................................................. 25
2.3 Méthode ................................................................................................................. 26
2.3.1 Calibration ...................................................................................................... 26
2.3.2 Protocole......................................................................................................... 26
3. Atellica .......................................................................................................................... 27
3.1 Principe .................................................................................................................. 27
3.2 Matériel .................................................................................................................. 28
3.3 Méthode ................................................................................................................. 28
3.3.1 Calibration ...................................................................................................... 28
3.3.2 Protocole......................................................................................................... 29
4. Algorithmes .................................................................................................................. 30
4.1 Diagnostic sepsis .................................................................................................... 30
4.2 Suivi de l’antibiothérapie ....................................................................................... 31
4.3 Diagnostic et initiation antibiothérapie des BPCO ................................................ 32
Résultats et discussions ............................................................................................................ 33
1. Diagnostic sepsis .......................................................................................................... 33
1.1 Description population .......................................................................................... 33
1.2 Comparaison de méthodes .................................................................................... 34
1.3 Interprétation des résultats de PCT sur le Mini Vidas ........................................... 36
1.3.1 Les vrais positifs .............................................................................................. 37
1.3.2 Les vrais négatifs ............................................................................................. 38
1.3.3 Les cas discordants ......................................................................................... 39
2. Suivi antibiothérapie .................................................................................................... 40
3. Diagnostic BPCO ........................................................................................................... 42
Conclusions ............................................................................................................................... 43
Liste des tableaux et liste des figures ....................................................................................... 44
Bibliographie ............................................................................................................................ 46
Annexes
6Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79985 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire La QF-PCR et le SWGS comme alternative à la méthode de CGH+SNP pour les analyses de produits de fausse couche / Florian Chavée
Titre : La QF-PCR et le SWGS comme alternative à la méthode de CGH+SNP pour les analyses de produits de fausse couche Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Florian Chavée, Auteur ; Véronique Vallery, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2021 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : IPG Institut de Pathologie et de Génétique Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les anomalies chromosomiques (principalement l’aneuploïdie) sont mises en cause dans environ 50% des fausses couches du premier trimestre. Outre la monosomie X et la triploïdie, les aneuploïdies les plus couramment rencontrées dans les produits de conception sont les trisomies pour les chromosomes 13, 15, 16, 18, 21 et 22. La technique d’analyse actuellement utilisée en première intention sur les produits de fausse couche à l’IPG, est la CGH+SNP. Cette méthode utilise l’ADN du patient et un ADN de référence, chacun d’eux sont marqués par un fluorochrome spécifique et hybridés de façon compétitive sur une micropuce. Le signal fluorescent est mesuré et un rapport entre les deux fluorescences est calculé afin de déterminer les pertes ou les gains de matériels génétiques. Pour diverses raisons, l’IPG souhaite revoir l’entièreté de son flux d’analyse des produits de fausse couche avec la mise en place d’une technique de séquençage (shallow sequencing) ainsi qu’une technique de PCR quantitative (kit QSTR-PL). Le shallow sequencing est une technique déjà utilisée à l’IPG. L’ADN est fragmenté, amplifié, séquencé et aligné sur un génome de référence afin de déterminer les pertes ou les gains de matériels génétiques. Le kit QSTR-PL permet l’amplification de STR présents sur des chromosomes spécifiques, ceux-ci sont analysés
quantitativement par un séquenceur capillaire. L’objectif de ce travail est de comparer les résultats obtenus avec l’ancien flux (CGH+SNP) et le nouveau flux (shallow sequencing et le kit QSTR-PL) dans le cadre des analyses de fausse couche. Pour ce faire, seize échantillons ont été sélectionnés et analysés par les différentes méthodes et comparés. Les résultats obtenus sont concluants, le nouveau flux apparaissant comme une alternative technique et financièrement intéressante à la technique du CGH+SNP. La totalité des résultats obtenus sont, en effet, identiques ou ont été améliorés pour un coût financier moindre. Les résultats étant validés, l'IPG pourra utiliser ce nouveau flux à l'avenir.Note de contenu : Table des matières
Le lieu de stage............................................................................................................................... 6
Introduction générale .................................................................................................................... 7
Partie théorique ............................................................................................................................. 8
Historique de la cytogénétique.......................................................................................... 8
Notions de base.................................................................................................................. 9
2.1. Le cycle de vie d’une cellule............................................................................................ 9
2.2. La division cellulaire ...................................................................................................... 11
2.3. Le brassage génétique................................................................................................... 13
2.4. Les chromosomes.......................................................................................................... 15
2.5. Les anomalies chromosomiques ................................................................................... 16
Les fausses couches.......................................................................................................... 20
3.1. Les facteurs de risque et causes ................................................................................... 21
3.2. Le traitement de l’échantillon....................................................................................... 23
Les méthodes d’analyse en cytogénétique à l’IPG pour les fausses couches.................. 24
4.1. Le caryotype standard................................................................................................... 24
4.2. Le caryotype moléculaire .............................................................................................. 24
4.3. La PCR quantitative en fluorescence............................................................................. 31
Objectif et stratégie ......................................................................................................... 32
Partie pratique ............................................................................................................................. 34
Matériel et méthode........................................................................................................ 34
6.1. Kit QSTR-PL.................................................................................................................... 35
6.2. Shallow sequencing....................................................................................................... 36
Résultats et discussions.................................................................................................... 41
7.1. Démarche scientifique .................................................................................................. 41
7.2. En CGH+SNP .................................................................................................................. 43
7.3. Avec le kit QSTR-PL........................................................................................................ 48
7.4. Avec le shallow sequencing........................................................................................... 53
7.5. Discussions .................................................................................................................... 59
Conclusion générale et perspectives ........................................................................................... 61
Liste des abréviations................................................................................................................... 62
Liste des figures............................................................................................................................ 63
Liste des tableaux......................................................................................................................... 66
Bibliographie ................................................................................................................................ 67
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100371 La QF-PCR et le SWGS comme alternative à la méthode de CGH+SNP pour les analyses de produits de fausse couche [TFE / Mémoire] / Florian Chavée, Auteur ; Véronique Vallery, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2021.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : IPG Institut de Pathologie et de Génétique Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les anomalies chromosomiques (principalement l’aneuploïdie) sont mises en cause dans environ 50% des fausses couches du premier trimestre. Outre la monosomie X et la triploïdie, les aneuploïdies les plus couramment rencontrées dans les produits de conception sont les trisomies pour les chromosomes 13, 15, 16, 18, 21 et 22. La technique d’analyse actuellement utilisée en première intention sur les produits de fausse couche à l’IPG, est la CGH+SNP. Cette méthode utilise l’ADN du patient et un ADN de référence, chacun d’eux sont marqués par un fluorochrome spécifique et hybridés de façon compétitive sur une micropuce. Le signal fluorescent est mesuré et un rapport entre les deux fluorescences est calculé afin de déterminer les pertes ou les gains de matériels génétiques. Pour diverses raisons, l’IPG souhaite revoir l’entièreté de son flux d’analyse des produits de fausse couche avec la mise en place d’une technique de séquençage (shallow sequencing) ainsi qu’une technique de PCR quantitative (kit QSTR-PL). Le shallow sequencing est une technique déjà utilisée à l’IPG. L’ADN est fragmenté, amplifié, séquencé et aligné sur un génome de référence afin de déterminer les pertes ou les gains de matériels génétiques. Le kit QSTR-PL permet l’amplification de STR présents sur des chromosomes spécifiques, ceux-ci sont analysés
quantitativement par un séquenceur capillaire. L’objectif de ce travail est de comparer les résultats obtenus avec l’ancien flux (CGH+SNP) et le nouveau flux (shallow sequencing et le kit QSTR-PL) dans le cadre des analyses de fausse couche. Pour ce faire, seize échantillons ont été sélectionnés et analysés par les différentes méthodes et comparés. Les résultats obtenus sont concluants, le nouveau flux apparaissant comme une alternative technique et financièrement intéressante à la technique du CGH+SNP. La totalité des résultats obtenus sont, en effet, identiques ou ont été améliorés pour un coût financier moindre. Les résultats étant validés, l'IPG pourra utiliser ce nouveau flux à l'avenir.Note de contenu : Table des matières
Le lieu de stage............................................................................................................................... 6
Introduction générale .................................................................................................................... 7
Partie théorique ............................................................................................................................. 8
Historique de la cytogénétique.......................................................................................... 8
Notions de base.................................................................................................................. 9
2.1. Le cycle de vie d’une cellule............................................................................................ 9
2.2. La division cellulaire ...................................................................................................... 11
2.3. Le brassage génétique................................................................................................... 13
2.4. Les chromosomes.......................................................................................................... 15
2.5. Les anomalies chromosomiques ................................................................................... 16
Les fausses couches.......................................................................................................... 20
3.1. Les facteurs de risque et causes ................................................................................... 21
3.2. Le traitement de l’échantillon....................................................................................... 23
Les méthodes d’analyse en cytogénétique à l’IPG pour les fausses couches.................. 24
4.1. Le caryotype standard................................................................................................... 24
4.2. Le caryotype moléculaire .............................................................................................. 24
4.3. La PCR quantitative en fluorescence............................................................................. 31
Objectif et stratégie ......................................................................................................... 32
Partie pratique ............................................................................................................................. 34
Matériel et méthode........................................................................................................ 34
6.1. Kit QSTR-PL.................................................................................................................... 35
6.2. Shallow sequencing....................................................................................................... 36
Résultats et discussions.................................................................................................... 41
7.1. Démarche scientifique .................................................................................................. 41
7.2. En CGH+SNP .................................................................................................................. 43
7.3. Avec le kit QSTR-PL........................................................................................................ 48
7.4. Avec le shallow sequencing........................................................................................... 53
7.5. Discussions .................................................................................................................... 59
Conclusion générale et perspectives ........................................................................................... 61
Liste des abréviations................................................................................................................... 62
Liste des figures............................................................................................................................ 63
Liste des tableaux......................................................................................................................... 66
Bibliographie ................................................................................................................................ 67
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=100371 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Qualification d’un kit ELISA commercial de dosage de la protéine A / Marie Léonard
Titre : Qualification d’un kit ELISA commercial de dosage de la protéine A Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Marie Léonard, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale Univercells Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le but de l’entreprise Univercells est de rendre disponible géographiquement et économiquement des molécules biothérapteutiques et des vaccins. Univercells en a d’ailleurs fait son slogan : « Biologics available to all »
Afin d’atteindre cet objectif, les équipes d’Univercells travaillent sur un processus de production et de purification d’un anticorps monoclonal, un biosimilaire de l’adalimumab (commercialisé sous le nom de HUMIRA® par AbbVie). Du fait de son affinité pour TNFα (un facteur pro-inflammatoire), l’adalimumab est une molécule de choix pour le traitement des maladies inflammatoires telle que la polyarthrite rhumatoïde.
La production de l’adalimimab se passe en plusieurs étapes : la première est une étape culture cellulaire et la seconde une étape de purification. Au cours de la purification, une colonne de chromatographie d’affinité à la protéine A est utilisée. Cette protéine possède une grande affinité pour les IgG et par conséquent pour le biosimilaire produit. Lors de l’élution de l’anticorps, de la protéine A peut se détacher de la colonne et se retrouver dans le produit fini. Cependant, elle ne peut pas être injectée au patient, du fait des effets toxicologiques qu’elle induit. La présence de cette protéine doit donc impérativement être dosée afin de s’assurer l’innocuité du produit fini.
C’est grâce à la technique ELISA, du fait de sa grande spécificité, et du kit Repligen® (9000-1), que cette protéine sera dosée. Cependant, avant d’être utilisée en routine, toute méthode analytique doit être qualifiée et validée. La qualification de cette méthode se base sur les règles de l’ICH Q2 R1, et a pour but l’évaluation de plusieurs paramètres comme : les effets matrice, la limite de quantification, la linéarité, la répétabilité, la précision intermédiaire, l’exactitude et l’intervalle de validité.
La qualification de cette méthode est le sujet de ce travail de fin d’étude. Au terme de celui-ci, les performances de la méthode auront été décrites et les conditions d’utilisation de celle-ci auront été définies et décrites dans une SOP (Standard Operating Procedur).Note de contenu : Présentation lieu de stage ..................................................................................................................... 10
Introduction ........................................................................................................................................... 12
1. Contexte général ........................................................................................................................... 13 La production de l’anticorps .................................................................................................. 15
La purification de l’anticorps ................................................................................................. 16
Le rôle de l’analytique ........................................................................................................... 18
La technique ELISA ................................................................................................................ 19
1.4.1 L’ELISA protéine A Repligen® ......................................................................................... 19
1.4.2 L’interprétation des ELISA ............................................................................................. 21 La validation .......................................................................................................................... 22
1.5.1 La limite de quantification ............................................................................................. 24
1.5.2 La linéarité ..................................................................................................................... 24
1.5.3 L’intervalle de validité ................................................................................................... 24
1.5.4 La précision : .................................................................................................................. 25
1.5.4.1 La précision intermédiaire ............................................................................................. 25
1.5.4.2 La répétabilité ................................................................................................................ 25
1.5.5 L’exactitude ................................................................................................................... 25
1.5.6 La spécificité .................................................................................................................. 26
2. Objectifs et stratégie ..................................................................................................................... 27
3. Matériel et méthodes .................................................................................................................... 28 Matériel ................................................................................................................................. 28
3.1.1 Réactifs .......................................................................................................................... 28
3.1.2 Equipements .................................................................................................................. 29 Méthode ................................................................................................................................ 29
3.2.1 Préparation des réactifs ................................................................................................ 29
3.2.2 Préparation des standards ............................................................................................ 30
3.2.3 Préparation des contrôles positifs ................................................................................. 31
3.2.4 Préparation des échantillons ......................................................................................... 31
3.2.4.1 Echantillons pour effet matrice ..................................................................................... 31
3.2.4.2 Echantillons pour la limite de quantification ................................................................ 33
3.2.4.3 Echantillons pour la linéarité ......................................................................................... 33
3.2.4.4 Echantillons pour la répétabilité et précision intermédiaire ........................................ 34
3.2.5 Principe de la méthode ................................................................................................. 36
4. Résultats et discussion .................................................................................................................. 37
Evaluation de l’effet matrice ................................................................................................. 37
La limite de quantification ..................................................................................................... 41
La linéarité ............................................................................................................................. 44
La répétabilité ........................................................................................................................ 46
La précision intermédiaire ..................................................................................................... 48
L’exactitude ........................................................................................................................... 49
Les paramètres étudiés lors de la qualification ..................................................................... 52
Les critères de validité ........................................................................................................... 53
Conclusion ............................................................................................................................................. 56
Liste des figures et tableaux .................................................................................................................. 57
Bibliographie.......................................................................................................................................... 59
Annexes ................................................................................................................................................. 61Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79994 Qualification d’un kit ELISA commercial de dosage de la protéine A [TFE / Mémoire] / Marie Léonard, Auteur ; Françoise Motte, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale Univercells Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Le but de l’entreprise Univercells est de rendre disponible géographiquement et économiquement des molécules biothérapteutiques et des vaccins. Univercells en a d’ailleurs fait son slogan : « Biologics available to all »
Afin d’atteindre cet objectif, les équipes d’Univercells travaillent sur un processus de production et de purification d’un anticorps monoclonal, un biosimilaire de l’adalimumab (commercialisé sous le nom de HUMIRA® par AbbVie). Du fait de son affinité pour TNFα (un facteur pro-inflammatoire), l’adalimumab est une molécule de choix pour le traitement des maladies inflammatoires telle que la polyarthrite rhumatoïde.
La production de l’adalimimab se passe en plusieurs étapes : la première est une étape culture cellulaire et la seconde une étape de purification. Au cours de la purification, une colonne de chromatographie d’affinité à la protéine A est utilisée. Cette protéine possède une grande affinité pour les IgG et par conséquent pour le biosimilaire produit. Lors de l’élution de l’anticorps, de la protéine A peut se détacher de la colonne et se retrouver dans le produit fini. Cependant, elle ne peut pas être injectée au patient, du fait des effets toxicologiques qu’elle induit. La présence de cette protéine doit donc impérativement être dosée afin de s’assurer l’innocuité du produit fini.
C’est grâce à la technique ELISA, du fait de sa grande spécificité, et du kit Repligen® (9000-1), que cette protéine sera dosée. Cependant, avant d’être utilisée en routine, toute méthode analytique doit être qualifiée et validée. La qualification de cette méthode se base sur les règles de l’ICH Q2 R1, et a pour but l’évaluation de plusieurs paramètres comme : les effets matrice, la limite de quantification, la linéarité, la répétabilité, la précision intermédiaire, l’exactitude et l’intervalle de validité.
La qualification de cette méthode est le sujet de ce travail de fin d’étude. Au terme de celui-ci, les performances de la méthode auront été décrites et les conditions d’utilisation de celle-ci auront été définies et décrites dans une SOP (Standard Operating Procedur).Note de contenu : Présentation lieu de stage ..................................................................................................................... 10
Introduction ........................................................................................................................................... 12
1. Contexte général ........................................................................................................................... 13 La production de l’anticorps .................................................................................................. 15
La purification de l’anticorps ................................................................................................. 16
Le rôle de l’analytique ........................................................................................................... 18
La technique ELISA ................................................................................................................ 19
1.4.1 L’ELISA protéine A Repligen® ......................................................................................... 19
1.4.2 L’interprétation des ELISA ............................................................................................. 21 La validation .......................................................................................................................... 22
1.5.1 La limite de quantification ............................................................................................. 24
1.5.2 La linéarité ..................................................................................................................... 24
1.5.3 L’intervalle de validité ................................................................................................... 24
1.5.4 La précision : .................................................................................................................. 25
1.5.4.1 La précision intermédiaire ............................................................................................. 25
1.5.4.2 La répétabilité ................................................................................................................ 25
1.5.5 L’exactitude ................................................................................................................... 25
1.5.6 La spécificité .................................................................................................................. 26
2. Objectifs et stratégie ..................................................................................................................... 27
3. Matériel et méthodes .................................................................................................................... 28 Matériel ................................................................................................................................. 28
3.1.1 Réactifs .......................................................................................................................... 28
3.1.2 Equipements .................................................................................................................. 29 Méthode ................................................................................................................................ 29
3.2.1 Préparation des réactifs ................................................................................................ 29
3.2.2 Préparation des standards ............................................................................................ 30
3.2.3 Préparation des contrôles positifs ................................................................................. 31
3.2.4 Préparation des échantillons ......................................................................................... 31
3.2.4.1 Echantillons pour effet matrice ..................................................................................... 31
3.2.4.2 Echantillons pour la limite de quantification ................................................................ 33
3.2.4.3 Echantillons pour la linéarité ......................................................................................... 33
3.2.4.4 Echantillons pour la répétabilité et précision intermédiaire ........................................ 34
3.2.5 Principe de la méthode ................................................................................................. 36
4. Résultats et discussion .................................................................................................................. 37
Evaluation de l’effet matrice ................................................................................................. 37
La limite de quantification ..................................................................................................... 41
La linéarité ............................................................................................................................. 44
La répétabilité ........................................................................................................................ 46
La précision intermédiaire ..................................................................................................... 48
L’exactitude ........................................................................................................................... 49
Les paramètres étudiés lors de la qualification ..................................................................... 52
Les critères de validité ........................................................................................................... 53
Conclusion ............................................................................................................................................. 56
Liste des figures et tableaux .................................................................................................................. 57
Bibliographie.......................................................................................................................................... 59
Annexes ................................................................................................................................................. 61Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79994 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Recherche de cellules néoplasiques dans les liquides de ponction par cytométrie en flux / Fanny Watrin
Titre : Recherche de cellules néoplasiques dans les liquides de ponction par cytométrie en flux Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Fanny Watrin, Auteur ; Patrick Vankerkhoven, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2022 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur Langues : Français (fre) Mots-clés : Laboratoire de biologie clinique Marie Curie Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les liquides de ponctions sont des échantillons communément traités dans les laboratoires de biologie clinique. Se sont des matrices de choix pour la recherche de cellules néoplasiques et donc pour la détection et le diagnostic de cancers. Les cancers agressifs possèdent une tendance à métastaser, c’est-à-dire à a disséminer dans le corps. C’est lorsque ces cellules passeront dans les liquides qu’elle pourront être détectées et caractérisées. La méthode de référence consiste en une analyse cytologique et anatomopathologie du liquide. Celle-ci prend un certain temps et nécessite des techniciens expérimentés. Elle est aussi sujette à l’interprétation du technologue ce qui peut être délicat dans certains cas de figures. La méthode de recherche par cytométrie en flux permet notamment d’accélérer la remise des résultats mais aussi de confirmer ou infirmer le diagnostic rendu en cytologie. L’immunophénotypage des cellules tumorales permet également un traitement plus ciblé et donc plus efficace pour les patients.
La simplicité de la procédure mise en place représente une méthode de choix pour les laboratoires de biologie cliniqueNote de contenu : Table des matières
Introduction générale ............................................................................................................ 6
1. Partie théorique ............................................................................................................. 8
1.1. Les liquides de ponction ............................................................................................. 8
1.1.1. Généralités .............................................................................................................. 8
1.1.2. Composition .......................................................................................................... 11
1.1.3. Types de liquides................................................................................................... 13
1.1.3.1. Le liquide céphalo-rachidien ............................................................................. 13
1.1.3.2. Le liquide péricardique ...................................................................................... 15
1.1.3.3. Le liquide pleural ............................................................................................... 16
1.1.3.4. Le liquide péritonéal.......................................................................................... 17
1.1.3.5. Le liquide synovial ............................................................................................. 18
1.1.3.6. Le lavage broncho-alvéolaire ............................................................................ 19
1.1.4. Cellules retrouvées dans les liquides de ponctions .............................................. 20
1.1.4.1. Les leucocytes matures ..................................................................................... 21
1.1.4.1.1. Les polynucléaires ......................................................................................... 21
1.1.4.1.1.1. Les polynucléaires neutrophiles .................................................................... 21
1.1.4.1.1.2. Les polynucléaires éosinophiles .................................................................... 22
1.1.4.1.1.3. Les polynucléaires basophiles ....................................................................... 22
1.1.4.1.2. Les mononucléaires ....................................................................................... 22
1.1.4.1.2.1. Les lymphocytes ............................................................................................ 22
1.1.4.1.2.2. Les monocytes/macrophages ........................................................................ 23
1.1.4.2. Les cellules mésothéliales ................................................................................. 24
1.1.4.3. Les cellules ciliées .............................................................................................. 25
1.1.4.4. Les cellules néoplasiques .................................................................................. 25
1.2. La cytométrie en flux ................................................................................................ 27
1.2.1. Principe général .................................................................................................... 27
1.2.2. Focalisation hydrodynamique .............................................................................. 28
1.2.3. Excitation lumineuse ............................................................................................. 29
1.2.4. Principe optique .................................................................................................... 31
1.2.5. Détecteur et principe électronique ...................................................................... 33
1.2.6. Données récoltées ................................................................................................ 35
1.2.7. Marquage .............................................................................................................. 36
1.2.7.1. Les colorants fluorescents ................................................................................. 36
1.2.7.2. Les fluorochromes couplés à des anticorps ...................................................... 36
2. Partie pratique : ........................................................................................................... 37
2.2.1. Introduction .......................................................................................................... 37
2.2.2. Matériel et méthodes ........................................................................................... 37
2.2.2.1. Divers ................................................................................................................. 37
2.2.2.2. Appareillage ...................................................................................................... 37
2.2.2.3. Echantillons ....................................................................................................... 37
2.2.2.4. Réactifs : ............................................................................................................ 38
2.2.2.5. Préparation des réactifs .................................................................................... 39
2.2.2.6. Conservation des réactifs .................................................................................. 39
2.2.2.7. Préparation des échantillons ............................................................................ 39
2.2.2.8. Marquage .......................................................................................................... 41
2.2.2.9. Technique Lyse-Wash........................................................................................ 43
2.2.2.10. Réglages du cytomètre ...................................................................................... 43
2.2.2.10.1. Threshold ....................................................................................................... 43
2.2.2.10.2. Compensations .............................................................................................. 43
2.2.2.10.3. PMT (voltage) ................................................................................................ 44
2.2.2.11. Stratégie de « gating » ...................................................................................... 44
2.2.3. Résultats................................................................................................................ 45
2.2.3.1. Analyse d’un échantillon non pathologique ..................................................... 46
2.2.3.1.1. Sélection des singulets .................................................................................. 46
2.2.3.1.2. Exclusion des débris....................................................................................... 46
2.2.3.1.3. Sélection des cellules viables......................................................................... 46
2.2.3.1.4. Sélection des populations CD45- et CD45+ ................................................... 47
2.2.3.1.5. Analyse des sous populations leucocytaires ................................................. 48
2.2.3.1.6. Analyse des sous population lymphocytaires ............................................... 49
2.2.3.1.7. Analyse des cellules extra-hématologiques .................................................. 49
2.2.3.1.8. Evaluation du phénotype de la population néoplasique .............................. 50
2.2.3.1.9. Evaluation de la stabilité du flux lors de la phase d’acquisition des
données........................ ......................................................................................................... 50
2.2.3.1.10. Hiérarchie des gates et pourcentages ........................................................... 50
2.2.3.2. Analyse d’un échantillon pathologique............................................................. 51
2.2.3.2.1. Sélection des populations CD45- et CD45+ ................................................... 51
2.2.3.2.2. Analyse des sous populations leucocytaires et lymphocytaires ................... 51
2.2.3.3. Analyse des cellules extra-hématologiques ...................................................... 52
2.2.3.4. Evaluation du phénotype de la population néoplasique .................................. 52
2.2.3.5. Hiérarchie des gates et pourcentages............................................................... 53
2.2.3.6. Cas particuliers .................................................................................................. 53
2.2.3.6.1. Neutrophilie ................................................................................................... 54
2.2.3.6.2. Hyper lymphocytose ...................................................................................... 54
2.2.3.6.3. Hyper monocytose ........................................................................................ 54
2.2.3.6.4. Mortalité importante..................................................................................... 55
2.2.3.6.5. Présence de cellules mésothéliales ............................................................... 55
2.2.4. Discussion ............................................................................................................. 56
2.2.5. Conclusion ............................................................................................................. 58
Bibliographie ........................................................................................................................ 59
Liste des figures ................................................................................................................... 64
Liste des tableaux ................................................................................................................ 66
Abréviations......................................................................................................................... 67
Table des annexes ............................................................................................................... 68
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105749 Recherche de cellules néoplasiques dans les liquides de ponction par cytométrie en flux [TFE / Mémoire] / Fanny Watrin, Auteur ; Patrick Vankerkhoven, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2022.
Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez-vous connecter pour accéder à votre compte lecteur
Langues : Français (fre)
Mots-clés : Laboratoire de biologie clinique Marie Curie Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : Les liquides de ponctions sont des échantillons communément traités dans les laboratoires de biologie clinique. Se sont des matrices de choix pour la recherche de cellules néoplasiques et donc pour la détection et le diagnostic de cancers. Les cancers agressifs possèdent une tendance à métastaser, c’est-à-dire à a disséminer dans le corps. C’est lorsque ces cellules passeront dans les liquides qu’elle pourront être détectées et caractérisées. La méthode de référence consiste en une analyse cytologique et anatomopathologie du liquide. Celle-ci prend un certain temps et nécessite des techniciens expérimentés. Elle est aussi sujette à l’interprétation du technologue ce qui peut être délicat dans certains cas de figures. La méthode de recherche par cytométrie en flux permet notamment d’accélérer la remise des résultats mais aussi de confirmer ou infirmer le diagnostic rendu en cytologie. L’immunophénotypage des cellules tumorales permet également un traitement plus ciblé et donc plus efficace pour les patients.
La simplicité de la procédure mise en place représente une méthode de choix pour les laboratoires de biologie cliniqueNote de contenu : Table des matières
Introduction générale ............................................................................................................ 6
1. Partie théorique ............................................................................................................. 8
1.1. Les liquides de ponction ............................................................................................. 8
1.1.1. Généralités .............................................................................................................. 8
1.1.2. Composition .......................................................................................................... 11
1.1.3. Types de liquides................................................................................................... 13
1.1.3.1. Le liquide céphalo-rachidien ............................................................................. 13
1.1.3.2. Le liquide péricardique ...................................................................................... 15
1.1.3.3. Le liquide pleural ............................................................................................... 16
1.1.3.4. Le liquide péritonéal.......................................................................................... 17
1.1.3.5. Le liquide synovial ............................................................................................. 18
1.1.3.6. Le lavage broncho-alvéolaire ............................................................................ 19
1.1.4. Cellules retrouvées dans les liquides de ponctions .............................................. 20
1.1.4.1. Les leucocytes matures ..................................................................................... 21
1.1.4.1.1. Les polynucléaires ......................................................................................... 21
1.1.4.1.1.1. Les polynucléaires neutrophiles .................................................................... 21
1.1.4.1.1.2. Les polynucléaires éosinophiles .................................................................... 22
1.1.4.1.1.3. Les polynucléaires basophiles ....................................................................... 22
1.1.4.1.2. Les mononucléaires ....................................................................................... 22
1.1.4.1.2.1. Les lymphocytes ............................................................................................ 22
1.1.4.1.2.2. Les monocytes/macrophages ........................................................................ 23
1.1.4.2. Les cellules mésothéliales ................................................................................. 24
1.1.4.3. Les cellules ciliées .............................................................................................. 25
1.1.4.4. Les cellules néoplasiques .................................................................................. 25
1.2. La cytométrie en flux ................................................................................................ 27
1.2.1. Principe général .................................................................................................... 27
1.2.2. Focalisation hydrodynamique .............................................................................. 28
1.2.3. Excitation lumineuse ............................................................................................. 29
1.2.4. Principe optique .................................................................................................... 31
1.2.5. Détecteur et principe électronique ...................................................................... 33
1.2.6. Données récoltées ................................................................................................ 35
1.2.7. Marquage .............................................................................................................. 36
1.2.7.1. Les colorants fluorescents ................................................................................. 36
1.2.7.2. Les fluorochromes couplés à des anticorps ...................................................... 36
2. Partie pratique : ........................................................................................................... 37
2.2.1. Introduction .......................................................................................................... 37
2.2.2. Matériel et méthodes ........................................................................................... 37
2.2.2.1. Divers ................................................................................................................. 37
2.2.2.2. Appareillage ...................................................................................................... 37
2.2.2.3. Echantillons ....................................................................................................... 37
2.2.2.4. Réactifs : ............................................................................................................ 38
2.2.2.5. Préparation des réactifs .................................................................................... 39
2.2.2.6. Conservation des réactifs .................................................................................. 39
2.2.2.7. Préparation des échantillons ............................................................................ 39
2.2.2.8. Marquage .......................................................................................................... 41
2.2.2.9. Technique Lyse-Wash........................................................................................ 43
2.2.2.10. Réglages du cytomètre ...................................................................................... 43
2.2.2.10.1. Threshold ....................................................................................................... 43
2.2.2.10.2. Compensations .............................................................................................. 43
2.2.2.10.3. PMT (voltage) ................................................................................................ 44
2.2.2.11. Stratégie de « gating » ...................................................................................... 44
2.2.3. Résultats................................................................................................................ 45
2.2.3.1. Analyse d’un échantillon non pathologique ..................................................... 46
2.2.3.1.1. Sélection des singulets .................................................................................. 46
2.2.3.1.2. Exclusion des débris....................................................................................... 46
2.2.3.1.3. Sélection des cellules viables......................................................................... 46
2.2.3.1.4. Sélection des populations CD45- et CD45+ ................................................... 47
2.2.3.1.5. Analyse des sous populations leucocytaires ................................................. 48
2.2.3.1.6. Analyse des sous population lymphocytaires ............................................... 49
2.2.3.1.7. Analyse des cellules extra-hématologiques .................................................. 49
2.2.3.1.8. Evaluation du phénotype de la population néoplasique .............................. 50
2.2.3.1.9. Evaluation de la stabilité du flux lors de la phase d’acquisition des
données........................ ......................................................................................................... 50
2.2.3.1.10. Hiérarchie des gates et pourcentages ........................................................... 50
2.2.3.2. Analyse d’un échantillon pathologique............................................................. 51
2.2.3.2.1. Sélection des populations CD45- et CD45+ ................................................... 51
2.2.3.2.2. Analyse des sous populations leucocytaires et lymphocytaires ................... 51
2.2.3.3. Analyse des cellules extra-hématologiques ...................................................... 52
2.2.3.4. Evaluation du phénotype de la population néoplasique .................................. 52
2.2.3.5. Hiérarchie des gates et pourcentages............................................................... 53
2.2.3.6. Cas particuliers .................................................................................................. 53
2.2.3.6.1. Neutrophilie ................................................................................................... 54
2.2.3.6.2. Hyper lymphocytose ...................................................................................... 54
2.2.3.6.3. Hyper monocytose ........................................................................................ 54
2.2.3.6.4. Mortalité importante..................................................................................... 55
2.2.3.6.5. Présence de cellules mésothéliales ............................................................... 55
2.2.4. Discussion ............................................................................................................. 56
2.2.5. Conclusion ............................................................................................................. 58
Bibliographie ........................................................................................................................ 59
Liste des figures ................................................................................................................... 64
Liste des tableaux ................................................................................................................ 66
Abréviations......................................................................................................................... 67
Table des annexes ............................................................................................................... 68
Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=105749 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Recherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 / Anaïs Dupuis
Titre : Recherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 Type de document : TFE / Mémoire Auteurs : Anaïs Dupuis, Auteur ; Louise-Marie Vincent, Directeur de la recherche Editeur : Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale Année de publication : 2019 Note générale : Le fichier numérique de ce document est disponible uniquement pour les membres de la Haute Ecole Louvain-en-Hainaut ainsi que ses étudiants. Veuillez vous connecter pour accéder à votre compte lecteur. Langues : Français (fre) Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La paraplégie spastique héréditaire de type 21 est une maladie autosomale récessive causée par des mutations dans le gène SPG21. Celui-ci code pour la maspardine, une protéine de fonction inconnue associée au feuillet cytosolique de la membrane lysosomale.
Sur base d’une recherche bibliographique, il a été postulé que la maspardine pourrait jouer un rôle dans le transport de matériel dans la cellule. Ce transport aurait lieu dans de petites vésicules qui voyageraient vers ou à partir du système endolysosomal. Une analyse préliminaire a en effet suggéré que la maspardine pourrait interagir avec plusieurs protéines de la famille COPI qui sont impliquées dans des mécanismes de transport vésiculaire. Dans le cadre de ce travail, nous avons validé l’une de ces interactions protéiques. Grâce à la technique d’immunoprécipitation, nous avons mis en évidence une interaction entre la maspardine et la protéine COP E dans un modèle cellulaire humain.
Dans la seconde partie du travail, nous avons participé à la caractérisation du phénotype de cellules HeLa déficientes pour la maspardine. Par des techniques de qRT-PCR et de microscopie à fluorescence, nous avons mis en avant que ces cellules présentent un taux d’ARNm du facteur de transcription EB (TFEB) diminué et que celui-ci est plus fréquemment détecté dans le noyau, alors qu’une localisation cytosolique est prédominante dans les cellules contrôles. De plus, nous avons observé que la localisation nucléaire de TFEB se traduit par une augmentation de la transcription et ensuite traduction de CTSD, un gène qui fait partie du réseau de gènes régulés par TFEB.
Sachant que l’activation de TFEB dépend d’une plateforme de signalisation lysosomale qui est sensible à des changements au niveau du contenu de ces organites, ces résultats sont compatibles avec l’hypothèse selon laquelle la maspardine pourrait intervenir dans le transport de matériel vers ou à partir des lysosomes. Nous n’excluons cependant pas une action plus directe de la maspardine sur la plateforme de signalisation elle-même. Des analyses supplémentaires seront nécessaires pour identifier le type de transport auquel la maspardine participe (organite de départ et d’arrivée, type de cargos transportés, autres partenaires d’interaction, …), et pour identifier précisément comment la maspardine régule l’activation de TFEB.Note de contenu : Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction générale ....................................................................................................... 7
Partie théorique ................................................................................................................ 9
1. Paraplégie spastique ................................................................................................. 9
1.1. Généralités ...................................................................................................................................... 9
1.2. Paraplégie spastique de type 21 (SPG21) et maspardine ............................................................... 9
2. Le système endolysosomal ....................................................................................... 11
2.1. Généralités .................................................................................................................................... 11
2.2. Endosome précoce ........................................................................................................................ 11
2.3. Endosome tardif ............................................................................................................................ 12
2.4. Lysosome ....................................................................................................................................... 12
3. Envoi du matériel à dégrader vers les lysosomes ...................................................... 14
3.1. Endocytose .................................................................................................................................... 14
3.2. Autophagie .................................................................................................................................... 15
4. Mise en contexte de la partie pratique ..................................................................... 17
Partie Pratique ............................................................................................................... 21
1. Matériels et méthodes ............................................................................................. 21
1.1. Traitement des cellules ................................................................................................................. 21
1.1.1. Mise en culture ......................................................................................................................... 21
1.1.2. Transfection des cellules .......................................................................................................... 21
1.2. Préparation de lysats cellulaires.................................................................................................... 22
1.3. Co-immunoprécipitation ............................................................................................................... 22
1.4. Western blotting ........................................................................................................................... 23
1.5. Fractionnement subcellulaire........................................................................................................ 25
1.5.1. Préparation d’une fraction enrichie en noyaux ........................................................................ 25
1.5.2. Dosage des protéines par la méthode de Bradford ................................................................. 26
1.5.3. Dosage de la DPPIII ................................................................................................................... 26
1.6. Analyse de la viabilité cellulaire .................................................................................................... 27
1.7. Analyse de l’expression d’un ARNm par qRT-PCR ......................................................................... 27
1.8. Analyse par microscopie à fluorescence ....................................................................................... 28
2. Résultats ................................................................................................................. 31
2.1. Etude des partenaires d’interaction de la maspardine ................................................................. 31
2.1.1. Tests de surexpression des protéines maspardine, COP G et COP E dans les cellules HeLa .... 34
2.1.2. Etude d’une interaction potentielle entre la maspardine et les protéines COP G et COP E par la technique de co-immunoprécipitation (co-IP) .................................................................................... 37
2.1.3. Etude du niveau d’expression et observation de COPE par immunofluorescence dans des cellules HeLa déficientes pour la maspardine ........................................................................................ 39
2.2. Etude de la distribution intracellulaire de TFEB (noyau versus cytosol) dans les cellules déficientes en maspardine .......................................................................................................................... 43
2.2.1. Analyse de la localisation subcellulaire de TFEB en conditions de culture riches en nutriments ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..44
2.2.2. Analyse de la distribution subcellulaire de GFP-TFEB dans les cellules contrôles et déficientes en maspardine, après induction d’une surcharge lysosomale ............................................................... 51
Conclusions, discussion et perspectives ............................................................................ 59
Liste des abréviations...................................................................................................... 63
Bibliographie .................................................................................................................. 64
5Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79988 Recherche de la fonction de la maspardine, une protéine déficiente dans la paraplégie spastique 21 [TFE / Mémoire] / Anaïs Dupuis, Auteur ; Louise-Marie Vincent, Directeur de la recherche . - Montignies-sur-Sambre : Helha. Paramédical - Biologie médicale, 2019.
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Langues : Français (fre)
Mots-clés : biologie médicale UNamur Index. décimale : TFE Bio Med TFE Biologie médicale Résumé : La paraplégie spastique héréditaire de type 21 est une maladie autosomale récessive causée par des mutations dans le gène SPG21. Celui-ci code pour la maspardine, une protéine de fonction inconnue associée au feuillet cytosolique de la membrane lysosomale.
Sur base d’une recherche bibliographique, il a été postulé que la maspardine pourrait jouer un rôle dans le transport de matériel dans la cellule. Ce transport aurait lieu dans de petites vésicules qui voyageraient vers ou à partir du système endolysosomal. Une analyse préliminaire a en effet suggéré que la maspardine pourrait interagir avec plusieurs protéines de la famille COPI qui sont impliquées dans des mécanismes de transport vésiculaire. Dans le cadre de ce travail, nous avons validé l’une de ces interactions protéiques. Grâce à la technique d’immunoprécipitation, nous avons mis en évidence une interaction entre la maspardine et la protéine COP E dans un modèle cellulaire humain.
Dans la seconde partie du travail, nous avons participé à la caractérisation du phénotype de cellules HeLa déficientes pour la maspardine. Par des techniques de qRT-PCR et de microscopie à fluorescence, nous avons mis en avant que ces cellules présentent un taux d’ARNm du facteur de transcription EB (TFEB) diminué et que celui-ci est plus fréquemment détecté dans le noyau, alors qu’une localisation cytosolique est prédominante dans les cellules contrôles. De plus, nous avons observé que la localisation nucléaire de TFEB se traduit par une augmentation de la transcription et ensuite traduction de CTSD, un gène qui fait partie du réseau de gènes régulés par TFEB.
Sachant que l’activation de TFEB dépend d’une plateforme de signalisation lysosomale qui est sensible à des changements au niveau du contenu de ces organites, ces résultats sont compatibles avec l’hypothèse selon laquelle la maspardine pourrait intervenir dans le transport de matériel vers ou à partir des lysosomes. Nous n’excluons cependant pas une action plus directe de la maspardine sur la plateforme de signalisation elle-même. Des analyses supplémentaires seront nécessaires pour identifier le type de transport auquel la maspardine participe (organite de départ et d’arrivée, type de cargos transportés, autres partenaires d’interaction, …), et pour identifier précisément comment la maspardine régule l’activation de TFEB.Note de contenu : Remerciements
Présentation du lieu de stage
Introduction générale ....................................................................................................... 7
Partie théorique ................................................................................................................ 9
1. Paraplégie spastique ................................................................................................. 9
1.1. Généralités ...................................................................................................................................... 9
1.2. Paraplégie spastique de type 21 (SPG21) et maspardine ............................................................... 9
2. Le système endolysosomal ....................................................................................... 11
2.1. Généralités .................................................................................................................................... 11
2.2. Endosome précoce ........................................................................................................................ 11
2.3. Endosome tardif ............................................................................................................................ 12
2.4. Lysosome ....................................................................................................................................... 12
3. Envoi du matériel à dégrader vers les lysosomes ...................................................... 14
3.1. Endocytose .................................................................................................................................... 14
3.2. Autophagie .................................................................................................................................... 15
4. Mise en contexte de la partie pratique ..................................................................... 17
Partie Pratique ............................................................................................................... 21
1. Matériels et méthodes ............................................................................................. 21
1.1. Traitement des cellules ................................................................................................................. 21
1.1.1. Mise en culture ......................................................................................................................... 21
1.1.2. Transfection des cellules .......................................................................................................... 21
1.2. Préparation de lysats cellulaires.................................................................................................... 22
1.3. Co-immunoprécipitation ............................................................................................................... 22
1.4. Western blotting ........................................................................................................................... 23
1.5. Fractionnement subcellulaire........................................................................................................ 25
1.5.1. Préparation d’une fraction enrichie en noyaux ........................................................................ 25
1.5.2. Dosage des protéines par la méthode de Bradford ................................................................. 26
1.5.3. Dosage de la DPPIII ................................................................................................................... 26
1.6. Analyse de la viabilité cellulaire .................................................................................................... 27
1.7. Analyse de l’expression d’un ARNm par qRT-PCR ......................................................................... 27
1.8. Analyse par microscopie à fluorescence ....................................................................................... 28
2. Résultats ................................................................................................................. 31
2.1. Etude des partenaires d’interaction de la maspardine ................................................................. 31
2.1.1. Tests de surexpression des protéines maspardine, COP G et COP E dans les cellules HeLa .... 34
2.1.2. Etude d’une interaction potentielle entre la maspardine et les protéines COP G et COP E par la technique de co-immunoprécipitation (co-IP) .................................................................................... 37
2.1.3. Etude du niveau d’expression et observation de COPE par immunofluorescence dans des cellules HeLa déficientes pour la maspardine ........................................................................................ 39
2.2. Etude de la distribution intracellulaire de TFEB (noyau versus cytosol) dans les cellules déficientes en maspardine .......................................................................................................................... 43
2.2.1. Analyse de la localisation subcellulaire de TFEB en conditions de culture riches en nutriments ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..44
2.2.2. Analyse de la distribution subcellulaire de GFP-TFEB dans les cellules contrôles et déficientes en maspardine, après induction d’une surcharge lysosomale ............................................................... 51
Conclusions, discussion et perspectives ............................................................................ 59
Liste des abréviations...................................................................................................... 63
Bibliographie .................................................................................................................. 64
5Permalink : ./index.php?lvl=notice_display&id=79988 Exemplaires
Cote Support Localisation Section Disponibilité aucun exemplaire Recherche de nouveaux inhibiteurs de la phosphosérine phosphatase (SerB2) - étude des interactions de petites molécules sur l’activité et l’inhibition de SerB2 par DSF et tests enzymatiques / Simon Cheval
PermalinkRégulation distale de la compétence chez Streptococcus salivarius / François Caussin
PermalinkRôle du récepteur CD27 dans la régulation de la réponse inflammatoire associée à l’obésité / Marie Vanhollebeke
PermalinkLe Shallow Sequencing comme alternative à la technique de CGH dans le cadre du diagnostic prénatal / Gaelle Benini
PermalinkSuivi à 3 et 6 mois des anomalies des analyses de l’hémostase de patients hospitalisés aux soins intensifs à cause de la COVID-19 / Loïc Gillard
PermalinkSurexpression et purification de la 2-Oxoglutarate/Fe(II)- dépendante chez Caulobacter crescentus / Grégoire Vanhaelen
PermalinkThe impact of global warming on Aedes aegypti’s worldwide spread / Lison Guillaume
PermalinkValidation du contrôle de la préanalytique du STAR Max 3 de Stago / Mélanie Baran
PermalinkValidation du dosage des catécholamines et substances apparentées par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem Présenté / Marine Freniere
PermalinkValidation du dosage des IgE totales sur le Phadia 250 par immunofluorescence / Luca Hutsenband
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